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《南昌大学》 2016年
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瑞香素联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的机制研究

李岩岩  
【摘要】:目的:探讨瑞香素(DAP)联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的机制,进一步探索DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒治疗RA的可能机制,为DAP的药用开发和RA的治疗思路提供理论与实验依据。方法:1.构建、鉴定Bcl-2-miRNA干扰质粒,分别采用克隆法及酶切、基因测序法。2.DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的机制:实验分组:(1)CIA大鼠滑膜细胞组(Control);(2)雷公藤甲素(40μg/ml)处理组(TP);(3)DAP(40μg/ml)处理组(DAP);(4)5-aza-Dc(20μM)处理组(5-aza-Dc);(5)Bcl-2-miRNA干扰质粒(8μg/ml)处理组(MR-Bcl-2);(6)DAP(40μg/ml)联合5-aza-Dc(20μM)处理组(DAP+5-aza-Dc);(7)DAP(40μg/ml)联合Bcl-2-miRNA干扰质粒(8μg/ml)处理组(DAP+MR-Bcl-2);(8)5-aza-Dc(20μM)联合Bcl-2-miRNA干扰质粒(8μg/ml)处理组(5-aza-Dc+MR-Bcl-2);(9)DAP(40μg/ml)联合5-aza-Dc(20μM)和Bcl-2-miRNA干扰质粒(8μg/ml)处理组(Combination);(10)空载质粒(8μg/ml)处理组(Mock)。按上述实验分组,脂质体法转染CIA大鼠滑膜细胞,检测如下指标:(1)RT-PCR检测CIA大鼠滑膜细胞Bcl-2、Bax、Bid基因及相关通路蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)mRNA表达情况;(2)甲基化特异性PCR(MSP)检测Bax,Bid甲基化状态(3)Annexin V/PI双染流式法检测滑膜细胞的凋亡率(4)Cell-based ELISA检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达(5)透射电镜观察CIA大鼠滑膜细胞超微结构改变。结果:1.成功构建Bcl-2-miRNA干扰质粒。2.DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡的机制:⑴DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒对CIA大鼠滑膜细胞Bcl-2、Bax、Bid基因及相关通路蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)mRNA表达情况的影响:各实验组Bcl-2 mRNA表达水平均较CIA组及Mock组明显降低(p0.05),Combination组Bcl-2 mRNA表达水平最低,为0.074±0.025。Bax、Bid、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达水平均较CIA组及Mock组明显升高(p0.05)。⑵DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒对CIA大鼠滑膜细胞Bax,Bid甲基化状态的影响:CIA大鼠滑膜细胞未处理组中其促凋亡基因Bax、Bid甲基化引物和非甲基化引物均扩增出特异性条带,即它们的启动子均呈部分高甲基化状态。第6组(DAP+5-aza-Dc组)的基因Bid经DAP和5-aza-Dc处理后甲基化扩增条带亮度降低,相应的非甲基化扩增条带亮度增高,而第3组(DAP组)基因Bid经DAP处理后甲基化扩增条带与相应的非甲基化扩增条带亮度无明显变化,由以上可推出5-aza-Dc对基因Bid有一定的去甲基化作用。其他实验组的基因Bid甲基化扩增条带与相应的非甲基化扩增条带亮度无明显变化。对于基因Bax,各实验组甲基化引物和非甲基化引物均扩增出特异性条带。⑶DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒对CIA大鼠滑膜细胞凋亡率的影响:各实验组凋亡率明显高于CIA组及Mock组(p0.05);Combination组早期和晚期凋亡率之和明显高于其他各组(p0.05)。⑷DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒对CIA大鼠滑膜细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响:各实验组Bcl-2蛋白表达水平均较CIA组及Mock组明显降低(p0.05)。各实验组Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平均较CIA组及Mock组明显升高(p0.05)。⑸透射电镜结果显示,Control:细胞呈椭圆形,核膜结构清晰,核浆比例大,核仁清晰;TP:染色质边聚,胞浆中出现少量空泡,胞浆丢失;DAP:染色质边聚,胞浆中出现大量空泡样结构,胞浆丢失严重,凋亡进一步发展;5-aza-Dc:细胞形态不规则,染色质浓聚,胞质内有少量空泡变性;MR-Bcl-2:胞质出现严重空泡变性,细胞核膜消失,凋亡小体形成;DAP+5-aza-dC:细胞形态不规则,染色质边聚,胞浆中出现许多空泡样结构;DAP+MR-Bcl-2:细胞失去正常结构,胞质空泡变性严重,胞浆大量丢失,细胞核膜消失,凋亡小体形成;5-aza-dC+MR-Bcl-2:染色质浓聚,胞质内有少量空泡变性;Combination:细胞失去正常结构,胞浆丢失严重,形成凋亡小体,呈典型的凋亡改变;Mock:细胞呈椭圆形,核膜结构清晰,核仁清晰。结论:1.DAP、5-aza-Dc、Bcl-2-miRNA干扰质粒分别单独作用CIA大鼠滑膜细胞可下调Bcl-2 mRNA及其相应蛋白表达水平,上调Bax、Bid、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA及其相应蛋白表达;2.DAP联合5-aza-Dc使CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因Bid启动子去甲基化,表达增加,促进滑膜细胞凋亡。3.DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒下调CIA大鼠滑膜细胞Bcl-2mRNA及其相应蛋白表达,上调Bax、Bid、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9mRNA及其相应蛋白表达,诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡;其诱导凋亡机制之一可能与DAP可下调Bcl-2、上调Bax、Bid,激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的凋亡途径诱导FLS凋亡有关。上述实验结果可望为RA的治疗思路以及DAP联合5-aza-Dc和Bcl-2-miRNA干扰质粒的药用开发提供理论与实验依据。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R593.22

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【参考文献】
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