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《南昌大学》 2018年
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敲除CCR3基因通过PI3K/Akt信号通路抑制小鼠嗜酸性粒细胞增殖、迁移及脱颗粒的实验研究

潘其彬  
【摘要】:第一部分:PI3K/Akt信号通路参与小鼠嗜酸性粒细胞增殖、迁移及脱颗粒的研究目的:研究PI3K/Akt信号通路对EOS脱颗粒、增殖及迁移作用的影响。方法:1.通过提取野生型C57BL/6小鼠骨髓细胞进行原代培养,在SCF及rm-FLt3及IL-5细胞因子的诱导下促进其分化为成熟的嗜酸性粒细胞2.通过瑞氏染色观察嗜酸性粒细胞形态学特征,通过流式细胞术检测嗜酸性粒细胞表面抗原Siglec-F的表达检测嗜酸性粒细胞的纯度3.实验分组:对照组、PI3K激动剂组(740Y-P)、PI3K抑制剂组(Ly294002)。通过CCK8分别检测不同浓度的PI3K抑制剂Ly294002及PI3K激动剂(740Y-P)对嗜酸性粒细胞增值活力的影响。ELISA检测嗜酸性粒细胞脱颗粒蛋白EPO的表达;Transwell检测嗜酸性粒细胞的迁移变化。Western Blot检测三组的P-AKT、AKT蛋白的表达情况结果:1.在同一时间点,与对照组比较,10uM、20uM的Ly294002均能抑制EOS的增殖活力,且在培养6h时,10uM Ly294002已表现出对EOS增殖活力的抑制(p0.05),且20uM Ly294002抑制更为明显(p0.01),而浓度为1uM无明显抑制效应(p0.05),当继续培养24h、48h各浓度抑制效应趋于稳定(p0.05);而予PI3K激动剂740Y-P处理后,在同一时间点,与对照组比较,1ug/ml 740Y-P对EOS的增殖活力无显著作用,当浓度为10ug/ml时,培养时间为6h,对EOS增殖活力有促进作用(p0.05),但当浓度上升至20ug/ml、50ug/ml时,可显著抑制EOS的增殖活力(p0.05),且在24h、48h各浓度的抑制效应趋于稳定(p0.05)。通过以上实验,我们最终筛选以10uM PI3K抑制剂Ly294002和10ug/ml PI3K激动剂740Y-P处理嗜酸性粒细胞6h为最佳浓度和时间用于后续的实验研究。2.迁移实验中PI3K激动剂组迁移的细胞数显著高于对照组(p0.01),而加入PI3K抑制剂后迁移细胞数明显低于对照组(p0.01),差异具有统计学意义3.嗜酸性粒细胞颗粒蛋白EPO的表达,PI3K激动剂组高于对照组(p0.05),相反,PI3K抑制剂组EPO的表达明显低于对照组(p0.01),差异具有统计学意义4.加入PI3K抑制剂Ly294002后,P-AKT及AKT的表达明显低于对照组(p0.01),加入PI3K激动剂740Y-P后,P-AKT的表达显著高于对照组(p0.05),而AKT的表达无明显变化(p0.05);结论:1.激活PI3K能够促进嗜酸性粒细胞的增殖、迁移及脱颗粒,阻断PI3K能够抑制嗜酸性粒细胞的增殖、迁移及脱颗粒2.PI3K调节嗜酸性粒细胞的增殖、迁移及脱颗粒,主要通过调节其下游磷酸化AKT的表达。第二部分敲除CCR3基因通过PI3K/Akt信号通路抑制小鼠嗜酸性粒细胞增殖、迁移及脱颗粒目的:通过上述实验我们得到PI3K/Akt信号通路参与小鼠嗜酸性粒细胞的增殖、迁移及脱颗粒过程,我们前期研究国自然研究也发现敲除CCR3基因能够抑制嗜酸性粒细胞的功能,促进嗜酸性粒细胞的凋亡。本实验探讨敲除CCR3基因是否是通过PI3K/Akt信号通路达到抑制嗜酸性粒细胞的增殖、迁移及脱颗粒。方法:1.条件性敲除CCR3基因小鼠的构建及鉴定2.分别提取野生型小鼠(wt)及敲除CCR3基因(CCR3-/-)小鼠骨髓细胞,在SCF及rm FLT3-L及rm IL-5细胞因子的诱导下促进其分化为成熟的嗜酸性粒细胞3.通过瑞氏染色观察两种嗜酸性粒细胞形态学特征并通过流式细胞术检测嗜酸性粒细胞表面抗原Siglec-F的表达检测嗜酸性粒细胞的纯度4.实验分组:wt EOS组、wt EOS+Eotaxin(100ng/ml)组、CCR3-/-Eos组、CCR3-/-Eos+Eotaxin(100ng/ml)组,分别通过CCK8观察三组6h、24h、48h对嗜酸性粒细胞增殖活力变化;ELISA检测嗜酸性粒细胞脱颗粒蛋白EPO的表达;Transwell检测嗜酸性粒细胞的迁移变化,Western Blot检测三组的P-AKT、AKT蛋白的表达情况;结果:1.敲除CCR3小鼠嗜酸性粒细胞增殖活力明显低于野生型小鼠嗜酸性粒细胞,并且在48h显著低于野生型小鼠嗜酸性粒细胞(p0.001),加入Eotaxin后,野生型小鼠嗜酸性粒细胞的活力高于其他三组,并且在6h活力明显高于野生型嗜酸性粒细胞组(p0.001)2.敲除CCR3基因小鼠嗜酸性粒细胞脱颗粒蛋白EPO的表达显著低于野生型小鼠嗜酸性粒细胞组(p0.01),加入Eotaxin,EPO的表达未见显著变化,而野生型嗜酸性粒细胞加入Eotaxin后,EPO的表达提高,高于其他三组(p0.05)3.敲除CCR3基因小鼠嗜酸性粒细胞迁移细胞数低于野生型小鼠嗜酸性粒细胞(p0.05),而加入Eotaxin,野生型小鼠嗜酸性粒细胞迁移细胞数明显增加,高于其他三组(p0.01),而敲除CCR3基因小鼠嗜酸性粒细胞加入Eotaxin,迁移细胞数无显著变化。4.敲除CCR3基因小鼠嗜酸性粒细胞,磷酸化蛋白P-AKT及AKT的表达低于野生型(p0.05),加入嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin后,野生型嗜酸性粒细胞磷酸化蛋白高于其他三组(p0.05),而AKT的表达量并未出现增加,而敲除CCR3基因小鼠嗜酸性粒细胞加入Eotaxin,P-AKT及AKT的表达量无明显变化(p0.05)结论:1.Eotaxin通过CCR3激活AKT途径进而促进嗜酸性粒细胞的增殖、迁移和脱颗粒2.敲除CCR3基因能够阻断AKT途径进而抑制嗜酸性粒细胞的增殖、迁移和脱颗粒。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R765.21

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