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《南昌大学》 2018年
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MiR-29a与Cdc42在胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌过程中的作用

陆相桐  
【摘要】:背景与目的:研究显示,细胞分裂调控蛋白42(Cdc42)在葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)的第二阶段发挥着重要的作用。在生理条件下,葡萄糖通过调节Cdc42在失活的Cdc42-GDP形式与具有活性的Cdc42-GTP形式之间来回转换从而发挥促进肌动蛋白细胞骨架重排和刺激胰岛素分泌的作用。伴随着糖尿病的发生发展,胰岛β细胞会出现不同程度的功能衰竭。抑制Cdc42会使胰岛素分泌受损但Cdc42对胰岛β细胞有无影响还有待探究。MicroRNAs(miRNAs)是短至大约22nt的非编码RNA。miRNAs已经被证实参与糖尿病的发病机制,包括胰岛素抵抗以及影响胰腺β细胞功能。MiR-29a是小鼠和人类胰腺β细胞中表达最丰富的miRNA之一。体外实验发现miR-29a对胰岛素的分泌发挥负调节作用,过表达miR-29a使得β细胞GSIS水平下降。与体外实验结果相反,有学者在小鼠体内敲除miR-29a后发现血糖值增高和血清胰岛素水平降低,miR-29a对胰岛素分泌发挥正向调节作用。因此miR-29a对胰岛素分泌的具体作用还需深入研究。MiR-29a在许多研究中已被证实影响细胞的增殖,miR-29a是否影响胰岛β细胞还有待探究。与此同时,在许多癌症研究中Cdc42被双荧光素酶报告基因测定法确定是miR-29a的体外直接靶基因。MiR-29a对Cdc42起到负调控作用,上调miR-29a会抑制Cdc42的表达。而在胰岛细胞中MiR-29a是否通过负调控Cdc42从而影响胰岛β细胞的增殖以及胰岛素的分泌值得我们进一步探究。故本实验的目的是探讨miR-29a与Cdc42对胰岛β细胞的增殖以及胰岛素分泌作用的影响。方法:1、观察miR-29a对MIN6细胞体外生物学功能的影响。分别瞬时转染miR-29a的mimics以及miR-29a的inhibitor至MIN6细胞中,用qPCR法检测miR-29a的表达水平。首先通过CCK分别检测过表达miR-29a以及干扰miR-29a表达后MIN6细胞系的增殖情况。其次在高糖浓度或基础浓度刺激下,用ELISA检测miR-29a对MIN6细胞系胰岛素分泌情况的影响。2、观察Cdc42对MIN6细胞体外生物学功能的影响。分别瞬时转染Cdc42过表达载体(Cdc42-pcDNA3.1)和Cdc42-siRNA至MIN6细胞系中,用qPCR和蛋白免疫印迹法检测Cdc42的表达水平。首先通过CCK分别检测过表达或者干扰Cdc42的表达后MIN6细胞系的增殖情况。其次在高糖或基础浓度刺激下,ELISA检测Cdc42对MIN6细胞系胰岛素分泌情况的影响。3、观察miR-29a是否通过Cdc42影响MIN6细胞增殖及胰岛素分泌。首先分别瞬时转染miR-29a的mimics以及miR-29a的inhibitor至MIN6细胞中,用WB法检测Cdc42的表达水平。其次过表达miR-29a和Cdc42后,通过CCK检测MIN6细胞系的增殖情况然后用ELISA检测MIN6细胞系胰岛素分泌情况。最后同时干扰miR-29a和Cdc42的表达后,先通过CCK检测MIN6细胞系的增殖情况其次用ELISA检测MIN6细胞系胰岛素分泌情况。结果:1、转染miR-29a-mimics后,MIN6细胞中miR-29a表达量增高(P0.01)。并且过表达miR-29a可抑制MIN6细胞系的增殖(P0.01)。在高糖刺激下miR-29a表达增高会使胰岛素分泌明显下降(P0.01)。在基础浓度刺激下miR-29a表达增高对胰岛素分泌无影响。转染miR-29a-inhibitor后,MIN6细胞中miR-29a表达量下降(P0.01)。并且干扰miR-29a的表达可促进MIN6细胞系的增殖(P0.01)。在高糖刺激下干扰miR-29a的表达会使胰岛素分泌明显上升(P0.01)。在基础浓度刺激下抑制miR-29a的表达对胰岛素分泌无影响。2、转染Cdc42-pcDNA3.1后,Cdc42在MIN6细胞中表达量增高(P0.05),促进MIN6细胞系的增殖(P0.05)。在高糖刺激下Cdc42的表达量增加会使胰岛素分泌明显上升(P0.05)。在基础浓度刺激下增加Cdc42的表达对胰岛素分泌无影响。转染Cdc42-siRNA后,Cdc42在MIN6细胞中表达量降低(P0.01),抑制MIN6细胞系的增殖(P0.01)。在高糖刺激下干扰Cdc42的表达会使胰岛素分泌明显下降(P0.01)。在基础浓度刺激下干扰Cdc42的表达对胰岛素分泌无影响。3、在MIN6细胞中转染miR-29a-mimics后,在蛋白水平Cdc42的表达下降(P0.01)。同时过表达miR-29a和Cdc42后,逆转了miR-29a-mimics对MIN6细胞系的增殖能力的抑制作用(P0.01)以及逆转了miR-29a-mimics在高糖浓度刺激下对胰岛素分泌的抑制作用(P0.01)。在MIN6细胞中转染miR-29a-inhibitor后,在蛋白水平Cdc42的表达上升(P0.01)。同时干扰miR-29a和Cdc42的表达逆转了miR-29a-inhibitor对MIN6细胞系的增殖能力的促进作用(P0.01)以及逆转了miR-29a-inhibitor在高糖浓度刺激下对胰岛素分泌的促进作用(P0.01)。结论:1、MiR-29a表达量增高抑制MIN6细胞系的增殖和在高糖刺激下的胰岛素分泌。干扰miR-29a的表达促进MIN6细胞系的增殖和在高糖刺激下的胰岛素分泌。2、Cdc42表达量升高促进MIN6细胞系的增殖和在高糖刺激下的胰岛素分泌。Cdc42表达量降低抑制MIN6细胞系的增殖和在高糖刺激下的胰岛素分泌。3、MiR-29a可通过抑制Cdc42表达,从而影响MIN6的增殖以及胰岛素的分泌。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R587.1

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