草鱼CHOP基因的克隆、表达及其转录调控分析

【摘要】：CHOP(又称DNA损伤诱导基因153(GADDl53)),作为生物体内普遍存在的一种转录调控因子,是C/EBP家族成员之一,在内质网应激介导的细胞凋亡中扮演着重要的作用。在本文中我们首先用同源基因克隆的方法克隆与鉴定了草鱼CHOP基因的全长cDNA序列(KX013389)及其启动子序列。CiCHOP cDNA全长1520bp,包括1个246bp的5′非翻译区、1个编码248个氨基酸的747bp的开放阅读框和1个527bp的3′非翻译区。CHOP蛋白在各物种中高度保守,其核心结构域均为“碱性亮氨酸拉链结构域(BRLZ)”。系统进化树分析显示,草鱼CHOP与其他鱼类分布在同一分支上具有较高的相似性,特别是与斑马鱼的进化关系显示最为接近。ATF4是细胞内质网应激中的关键调控因子。RT-PCR结果显示:不同浓度的衣霉素刺激均能诱导CiCHOP和CiATF4的表达上调。而随着刺激时间的增加,他们的表达量也出现明显上升并且表现出一致性,提示我们这两者之间可能存在一定的相互作用关系。为了进一步研究CHOP在外界刺激后的转录调控机制,我们克隆了CiCHOP的启动子序列并且原核表达和纯化了CiATF6和CiATF4蛋白。通过凝胶阻滞实验分析CiATF4和CiATF6与草鱼CHOP启动子之间的关系。结果显示,CiATF4和CiATF6均能够以高亲和力与CiCHOP的启动子结合,说明CiATF4和CiATF6是CiCHOP潜在的转录调控因子。双荧光素酶活性实验进一步研究CiATF4和CiATF6对CiCHOP的转录调控机制,构建了pGL3-CiCHOP的重组质粒并分别与pcDNA3.1-CiATF4、pcDNA3.1-CiATF6瞬时共转染到CIK细胞中。结果显示,ATF4和ATF6均能够显著上调草鱼CHOP的转录活性。细胞活性试验证明,在CIK细胞中CiCHOP的过表达能够引起细胞凋亡。