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《南昌大学》 2019年
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儿茶酚抑素参与大鼠背根神经节P2X_4受体介导的神经病理痛的研究

邓泽雨  
【摘要】:研究背景和目的:神经损伤引起的神经病理痛是一种常见的难治性疾病,初级感觉神经节的分子生物学变化在神经病理痛的发病机制中起着重要作用。磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)可作用于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)上卫星胶质细胞(satellite glial cells,SGCs)表面的P2X4受体,该过程与神经病理痛密切相关。近年来,来源于嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CHGA)的神经内分泌多肽儿茶酚抑素(Catestatin,CST)在急慢性疼痛中的作用备受关注,但其详细的作用机制仍不清楚。本研究旨在通过CST-siRNA下调CCI(chronic constriction injury)大鼠CST的表达以及通过向CCI大鼠鞘内注射CST来观察CST对P2X4受体介导CCI大鼠神经病理痛的影响及可能机理,为缓解甚至治愈神经病理痛提供一种新的思路。方法:将健康成年(180~220g)SD大鼠随机分为对照组(Ctrl)、假手术组(Sham)、坐骨神经慢性压迫性损伤组(CCI)、鞘内注射乱序多肽片段的坐骨神经慢性压迫性损伤组(CCI+NC)、鞘内注射CST的坐骨神经慢性压迫性损伤组(CCI+CST)、转染CST-siRNA的坐骨神经慢性压迫性损伤组(CCI+CST-siRNA)和转染乱序siRNA的坐骨神经慢性压迫性损伤组(CCI+NC-siRNA)。每组6只大鼠,每只大鼠均参与到了所有研究环节。根据不同分组,进行CCI大鼠建模,术后给药等相关操作。通过行为学检测观察各组实验大鼠机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)的变化情况;使用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测大鼠DRG中P2X4mRNA的水平变化;通过蛋白印迹(Western blot)实验方法检测各组大鼠DRG中 P2X4受体蛋白的表达;;免疫荧光双标(double-labeled immunofluorescence)实验方法检测各组大鼠DRG中卫星胶质细胞P2X4受体和GFAP的共表达;利用蛋白印迹检测MAPK、NF-k B相关信号通路的激活情况;通过酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β及DRG中CST含量水平进行检测。对上述结果进行统计学比较。结果:1、行为学结果显示,建模后,所有CCI大鼠的MWT和TWL较对照组大鼠降低(0.pH),对照组和Sham组在所有测试时间点均无统计学差异(p0.05);术后第1、3、5天,CCI组、CCI+CST组、CCI+NC组、CCI+CST-siRNA组和CCI+NC-siRNA组间MWT和TWL均无明显差异(p0.05);术后第7天到11 天,CCI+CST组的MWT和 TWL较CCI组降低(p0.01)CCI+CST-siRNA组的MWT和TWL较CCI+CST组升高((p0.01),CCI组、CCI+NC组和CCI+NC-siRNA组之间无明显差异(p0.05)。2、实时荧光定量PCR结果表明,CCI组大鼠DRG中P2X4 mRNA的水平高于对照组(p0.01),CCI+CST组P2X4mRNA的水平明显高于CCI组(p0.01),CCI+CST-siRNA组P2X4mRNA的水平明显低于CCI+CST组(p0.01)。3、蛋白印迹结果表明,CCI组大鼠DRG中P2X4受体蛋白的表达量高于对照组((p01),CCI+CST组P2X4受体蛋白表达量明显高于CCI组(p0.01),CCI+CST-siRNA组P2X4受体蛋白表达量明显低于CCI+CST组(p0.01);CCI组大鼠中p-p38与p38的积分光密度比值比对照组高(0.01),CCI+CST组p-p38与p38的积分光密度比值明显高于CCI组(p0.01),CCI+CST-siRNA组大鼠p-p38与p38的积分光密度比值较CCI+CST组显著降低(p0.01);p-ERK蛋白的各组表达趋势类似于p-p38;CCI大鼠p-JNK蛋白的表达量高于对照组(p0.01),而CCI+CST组与CCI组间无差异(p0.05),p-p65蛋白的各组表达趋势类似于p-JNK。4、免疫荧光双标实验结果显示,与CCI组相比,CCI+CST组大鼠DRG卫星胶质细胞P2X4受体与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的共表达明显增加;与CCI+CST组相比,CCI+CST-siRNA组大鼠共表达水平降低。5、酶联免疫吸附试验结果显示,与Ctrl组相比,CCI组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和DRG中CST含量增加(0.01);与CCI组相比,CCI+CST组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和DRG中CST增加(p0.01)。结论:CST可增强背根神经节卫星胶质细胞P2X4受体介导的CCI大鼠神经病理痛;卫星胶质细胞活化、p38和ERK-MAPK信号通路可能涉及其病理生理过程。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R741

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