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《南昌大学》 2020年
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HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP人工骨修复兔股骨头坏死模型的实验研究

吴洪亮  
【摘要】:目的:脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)是从脂肪组织中分离出的具有自我更新且能多向分化的间充质干细胞,可分化成多种细胞表型,促进成骨,进而促使骨修复。HIF-1α是血管内皮生长因子(VEGF)的上游基因,HIF-1α过表达能够增强VEGF在脂肪干细胞中的分泌,诱导新生血管的形成。髓芯减压联合组织工程骨移植治疗股骨头坏死,是一种治疗ANFH早期病变的较为成熟且有效的方法。本实验通过HIF-1α转染ADSCs复合HA/β-TCP人工骨移植治疗兔股骨头坏死,在早期改善或治愈缺血性改变或坏死的股骨头,为临床上修复早期股骨头坏死提供了实验依据。方法:第一部分研究使用雌性新西兰大白兔作为研究对象,模拟髓芯减压治疗早期股骨头坏死的治疗路径,利用克氏针对股骨头钻孔,随后利用液氮冷冻对股骨头进行冷冻处理。术后一个月观察骨的形态变化,并对股骨头行X线、micro-CT以及MRI,结合病理切片结果对液氮冷冻法构建兔股骨头坏死模型进行鉴定。第二部分研究主要通过体外分离兔的脂肪干细胞,分析HIF-1α对脂肪干细胞增殖、存活以及成骨分化能力,为临床预防和治疗股骨头坏死提供新的方向和理论基础。第三部分研究通过HIF-1α转染ADSCs复合HA/β-TCP人工骨移植治疗兔液氮冷冻股骨头坏死,旨在早期改善或治愈缺血性改变或坏死的股骨头,为临床上修复股骨头坏死提供了实验依据,也为临床上治疗早期股骨头坏死开辟了新路。第四部分研究主要通过RNA-seq和生物信息学分析和统计HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP治疗股骨头坏死过程中,移植前后股骨头中脂肪细胞的基因表达差异,并对其中表达差异明显的基因通过qPCR、western-blot和免疫荧光进行进一步的确认,证明芯片测序结果的可靠性。基于生物信息学的分析方法,我们能够初步了解股骨头坏死过程中影响脂肪干细胞成脂/成骨分化的关键调节基因,为进一步探究股骨头坏死的发病机制提供新的思路,为实现股骨头坏死的早期诊断提供新的标志物,为临床治疗股骨头坏死提供新的靶点和理论基础。结果:(1)术后X线及micro-CT证实孔道均打入相应的合适位置。国际上一般认为股骨头空骨陷窝率、骨髓内脂肪组织增生、以及BMD为股骨头坏死模型建立成功的核心标志,结合股骨头形态学变化,我们认为液氮冷冻法构建的兔股骨头坏死模型构建成功,可用于后续实验开展。本部分研究成功利用液氮冷冻法构建了兔股骨头坏死的模型。(2)HIF-1α能够促进脂肪干细胞的增殖和存活,促进脂肪干细胞的成骨分化,抑制脂肪干细胞的成脂分化,在治疗股骨头坏死和骨修复中具有潜在的应用价值。(3)液氮冷冻诱导的股骨头坏死会导致股骨头形态不规则,骨小梁稀疏,骨内脂肪组织增生验证,骨空骨陷窝率增多,但是移植HIF-1α转染脂肪干细胞和植入HA/β-TCP人工骨能够在一定程度上抑制骨小梁的破损以及空骨陷窝的产生,而两者联用则会显著缓解股骨头坏死的症状,起到很好的治疗股骨头坏死的效果。HIF-1α转染脂肪干细胞复合植入HA/β-TCP人工骨能够显著提高股骨头坏死的治疗效果。在未来临床治疗股骨头坏死时,HIF-1α转染脂肪干细胞复合植入HA/β-TCP人工骨可能是有效的治疗手段。(4)在HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP治疗股骨头坏死过程中,CGRP可能通过激活BMP信号通路来促进脂肪干细胞的成骨分化,进而起到治疗股骨头坏死的作用。结论:本研究成功利用液氮冷冻法构建了兔股骨头坏死模型;通过体外实验证明HIF-1α能够促进脂肪干细胞的成骨分化,抑制脂肪干细胞的成脂分化;通过兔股骨头坏死模型证明HIF-1α转染脂肪干细胞复合HA/β-TCP能够显著抑制股骨头坏死的发生,并进一步通过二代测序和生物信息学分析这个过程可能依赖CGRP激活BMP信号通路。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:R681.8;R-332

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