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《南昌大学》 2020年
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人卵巢子宫内膜异位症中MYH8基因突变及其功能研究

娄俊  
【摘要】:背景与目的:子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是子宫内膜腺体及间质等组织存活于子宫腔外并浸润生长的妇科常见病,主要症状包括盆腔疼痛、性交痛及不育等。EMs虽为良性疾病,却往往表现细胞增殖增强、向周围组织蔓延侵蚀等恶性肿瘤的生物学特性。研究发现,特定基因突变在EMs发生发展中扮演重要作用。肌球蛋白(Myosin)是一组高度保守、在所有真核细胞中均表达的蛋白质,其主要功能是参与转化细胞运动所需的机械能,在细胞迁移和肌肉收缩等过程过发挥作用。肌球蛋白重链8(MYH8)是肌球蛋白家族重要成员,可介导细胞的迁移和粘附等生物学过程。研究发现,包括肠癌、肺癌、卵巢癌和子宫内膜癌在内的多种肿瘤中均存在MYH8基因体细胞突变;功能研究表明MYH8表达异常可导致恶性肿瘤发生。因EMs具有异常增殖、凋亡、侵袭迁移等类肿瘤特征,我们假设EMs患者可能存在MYH8基因突变且在EMs发展中扮演重要作用,影响下游相关信号通路,共同促进EMs发病。方法:收集江西省妇幼保健院病理确诊的152名卵巢EMs患者静脉外周血和卵巢囊壁组织,以及485例非EMs卵巢良性疾病对照女性血和卵巢病变组织样品。经提取血和组织总DNA,PCR扩增、PCR产物纯化、直接测序和序列比对后,分析卵巢子宫内膜异位症患者MYH8基因突变及频率。由Origene公司购入pCMV6-MYH8-DDK过表达质粒,定点诱变分别获取MYH8不同突变型过表达质粒,将上述质粒转染于293T细胞,分别包装得出pCMV6-MYH8-DDK野生型和突变型慢病毒。上述病毒分别感染Ishikawa细胞后,检测Ishikawa细胞后的细胞生物学效应改变:Transwell小室实验去检测细胞侵袭和迁移,流式细胞仪检测细胞的凋亡水平和细胞周期,CCK-8法检测细胞增殖活力,细胞划痕实验验证细胞迁移能力,平板克隆实验检查细胞成瘤能力,以验证MYH8基因突变能否真正促进卵巢子宫内膜异位症发病。随后应用iTRAQ蛋白质组学技术检测pcDNA3.1空载对照、MYH8野生型、2个MYH8突变型的蛋白组学的改变,分析MYH8突变可能影响的下游基因及信号通路。结果:1、152例卵巢子宫内膜异位病变标本中存在2例MYH8 C.1441AC(p.I481L)和C.4057GA(p.E1353K)体细胞突变(1.3%),蛋白质结构模拟结果提示该突变可能会引起MYH8蛋白结构改变。随后,将EMs患者MYH8突变组与无EMs患者临床数据进行相关性分析,未发现与突变有关显著性临床指标。485例非EMs对照女性中未检测到这些MYH8基因突变。2、Transwell小室实验结果表明,相对于MYH8野生型,MYH8突变型(p.I481L、p.E1353K)能够增强Ishikawa细胞的侵袭和迁移能力(P0.05),而细胞增殖、细胞平板成瘤、凋亡及周期方面对比研究无统计学差异(P0.05)。3、iTRAQ技术检测结果表明:与MYH8野生型相比,2个MYH8突变型过表达的Ishikawa细胞共同上调的差异表达蛋白质有256个,下调差异表达蛋白质47个。生物信息分析后发现:MYH8野生型与突变型过表达Ishikawa细胞之间存在6个细胞运动相关蛋白表达差异,提示MYH8突变可能通过这些基因表达异常而促进EMs发病。结论:1、本研究中首次在卵巢子宫内膜异位症中发现MYH8 p.I481L(c.1441AC)和p.E1353K(C.4057GA)新突变(1.3%),且该突变能够导致蛋白质结构改变。2、这两个MYH8新突变能够增强Ishikawa细胞侵袭、迁移(P0.05),但是对细胞增殖、细胞平板成瘤、凋亡及周期等无明显影响,提示MYH8新突变可能通过影响细胞的转移能力而促进卵巢子宫内膜异位症的发生。3、iTRAQ蛋白质组学检测结果表明MYH8野生型与突变型过表达Ishikawa细胞之间存在6个细胞运动相关蛋白表达存在差异,提示MYH8突变可能通过这些基因/信号通路促进EMs发病。4、MYH8突变与患者临床数据之间未发现显著相关性。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:R711.71

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