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《南昌大学》 2020年
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膜表达IL-21的K562扩增脐血NK细胞对结直肠癌的治疗作用研究

徐晨  
【摘要】:研究背景结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,死亡率高居恶性肿瘤第2位,其恶性程度高、进展快、长期生存率和预后比较差,探索一种有效的新方法治疗结直肠癌仍具有非常重大的临床意义。NK细胞过继免疫疗法是一种重要的肿瘤生物治疗方法,在体内直接或间接杀死肿瘤细胞以达到癌症治疗的目的。如何获得足够的NK细胞以及如何在体内维持NK细胞的活性是NK免疫治疗中的一个难题。脐带血含NK细胞比例较高,不容易出现移植物抗宿主病,它被认为是NK细胞的理想来源。白细胞介素-21(IL-21)是调节NK细胞增殖和作用的重要细胞因子,促进NK细胞的体外增殖,上调NK细胞的活性。研究目的本研究通过基因工程技术构建膜表达IL-21的K562细胞作为饲养细胞,体外扩增脐带血来源的NK细胞(eUCB-NK),通过检测扩增细胞的数目和功能,评价这种扩增方案的效率,并进一步通过细胞实验和动物实验,探讨经此方案扩增的脐带血来源的NK细胞单独或联合贝伐单抗治疗结直肠癌的可能性及效果,期待能为结直肠癌患者提供新的治疗方案。研究方法(1)构建重组表达IL-21的质粒,转染293T细胞进行慢病毒包装,包装产生的慢病毒颗粒感染K562细胞,通过有限稀释法获得成功稳定表达IL-21的K562细胞(K562-mb21),采用流式方法检测K562-mb21上IL-21的表达。从人脐带血中分离出单个核细胞(UCB-MNC),与K562-mb21共同培养,通过流式方法检测扩增效率。(2)采用流式细胞技术检测eUCB-NK细胞表型变化。采用LDH释放检测和脱颗粒检测评价eUCB-NK细胞体外对结直肠癌细胞的杀伤作用。采用ELISA方法检测eUCB-NK细胞因子的分泌情况。(3)建立人结直肠癌HT29和LoVo皮下移植瘤动物模型,进行过继性治疗,观察eUCB-NK的对肿瘤的抑制作用,流式方法检测NK细胞浸润肿瘤组织情况,通过RT-PCR方法检测小鼠血管新生指标和NK细胞浸润情况。联合eUCB-NK和贝伐单抗抑制LoVo瘤,免疫组化检测其NK细胞浸润情况。结果(1)经转染后的K562-mb21细胞膜表面高水平表达IL-21,经K562-mb21的刺激后,eUCB-NK细胞大量扩增,CD56~+CD3~-的细胞在UCB-MNC中的比例增加,而T细胞比例下降。(2)与单用IL-2刺激扩增的NK细胞(对照组)相比,eUCB-NK细胞活化受体NKG2D、TRAIL表达上调,抑制受体无明显变化。eUCB-NK细胞造成的肿瘤细胞凋亡比例明显高于对照组,并未造成更多的正常PBMC凋亡。在杀伤过程中,eUCB-NK细胞表面CD107a表达水平明显提高,多种效应细胞因子释放明显增强,如IFN-γ,TNF-α,GM-CSF和CCL3等。(3)过继eUCB-NK细胞能够显著抑制HT29皮下移植瘤模型生长,而不能有效抑制LoVo肿瘤。流式发现,HT29肿瘤组织的NK细胞浸润程度明显高于LoVo肿瘤。RT-PCR显示HT29肿瘤中血管生成标记物显著低于LoVo肿瘤,而HT29肿瘤中NK细胞标记物CD56显著高于LoVo肿瘤。贝伐单抗和eUCB-NK细胞联用增加了LoVo肿瘤组织中NK细胞浸润,增强了肿瘤的抑制作用。结论(1)建立了高水平膜表达IL-21的K562细胞并将其用于扩增脐带血NK细胞,扩增效率高,扩增的NK细胞活性和毒性高,在体外显著杀伤结直肠癌细胞;(2)膜表达IL-21的K562扩增脐血NK细胞在体内可以抑制结直肠癌异种移植模型的肿瘤生长,其过继免疫治疗的效果与NK细胞在组织中的浸润程度相关,联用抗血管生成药物可增强NK细胞的浸润,提高NK细胞对肿瘤的抑制效果。
【学位授予单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:R735.34

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