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《江西农业大学》 2011年
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猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别

季华员  
【摘要】：产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli ETEC)是引发新生及断奶仔猪腹泻和水肿的主要致病菌。ETEC主要存在五种血清型,包括F4、F41、F5、F6和F18。ETEC F41作为其中的一种血清型,是引起仔猪腹泻的重要病原菌之一,其通过表面表达的黏附素与猪小肠上皮细胞的特异性受体结合,释放肠毒素进而引起大量电解质和水渗入肠腔,从而导致仔猪腹泻。 本课题组前期利用183个微卫星标记在大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体中开展全基因组扫描,将ETECF41受体基因初步定位在猪4号染色体SW2509和S0301标记间约6.04 Mb的区域。在此基础上,本研究通过在SSC4 QTL目标区域增加7个微卫星标记,对其在同一资源群体(包括816个F2个体及所有Fo与F1个体)中开展基因分型,进一步将ETEC F41受体基因精细定位至标记SW2509至KVL2754之间约2.42 Mb的区域,为鉴别ETEC F41受体目的基因奠定了良好的工作基础。 在所定位的2.42 Mb目标区域中,采用比较基因组学分析,揭示该区域目前存在21个基因,从中选取6个可能的位置候选基因(包括ST3GAL1、TMEM71、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KCNQ3基因)通过半定量RT-PCR检测其在猪空肠组织中的表达,结果表明这6个基因在空肠中均表达。进一步结合ETEC F41受体的理化特性选择ST3p-半乳糖α-2,3唾液酸转移酶1(ST3GAL1)基因作为ETEC F41受体的重要位置候选基因加以研究。采用5'RACE和3'RACE技术,分离了ST3GAL1基因全长1637 bp的cDNA序列,其中开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1032 bp,编码343个氨基酸。通过比较测序法在ST3GAL1基因内共鉴别到62个多态位点,其中2个错义突变(ST3GAL1 c.284TA和ST3GAL1 c.661AG),11个同义突变,49个内含子上的突变。采用PCR-RFLP和PCR-SNaPshot方法对ST3GAL1 c.284TA(位于第1外显子)、c.477CT(位于第2外显子)及c.661AG(位于第3外显子)等3个多态位点在白色杜洛克×二花脸资源家系所有个体中进行多态性检测。传递不平衡检测表明除c.477CT位点外,另两个多态位点的等位基因及所有单倍型均与ETEC F41的易感性呈极显著相关(P0.01)。为此,本实验选择两个强关联的SNPs位点(ST3GAL1c.284TA及c.661AG)进一步在287头中、西方猪种远缘群体中开展遗传多态性分析,采用Case Control力法分析,结果表明ST3GAL1 c.284TA及c.661AG两个多态位点在中、西方猪种远缘群体中与ETEC F41黏附表型关联性均不显著。由此提示ST3GAL1基因与ETECF41黏附表型的关联性可能存在群体异质性,另外ST3GAL1基因可能不是目的基因而仅是与目的基因处于一定连锁不平衡状态的一个标记位点。 为了获得更高的基因定位精度,本研究采用猪全基因组高通量60K SNP芯片对白色杜洛克×二花脸资源群体开展全基因组关联分析(Genome-wide association study, G WAS),以精细定位ETEC F41受体基因位点。GWAS结果显示,与ETEC F41黏附表型具有最显著关联的SNP位点为H3GA0011673 CT(P=1.09E-09),与其临近的两个多态位点为ASGA0017715 TC和ASGA0017733 CT。进一步对这三个多态位点在287头中、西方猪种中采用PCR-SNaPshot方法进行多态性检测,结果表明仅ASGA0017733 CT多态位点在西方猪种中与ETEC F41黏附表型显著关联。由此提示,ASGA0017733 CT位点可能是与目的基因处于连锁不平衡的一个重要标记,这为进一步开展位置候选基因研究奠定良好的基础。 ASGA0017733 CT位点位于ZFAT基因第3内含子上,结合受体生理生化分析,本实验选择ZFAT (zinc finger and AT hook domain containing)作为ETEC F41受体位置候选基因进一步深入研究。采用RACE技术分离得到长4108 bp的猪ZFAT cDNA序列,开放阅读框(ORF)长3393 bp,编码1130个氨基酸。通过比较测序在ZFAT基因编码区鉴别到c.60CT、c.630AC、c.660TC、c.1077TC、c.1416TC、c.2337TC及c.2935GC共7个多态位点,其中1个为错义突变,6个为同义突变。采用PCR-SNaPshot技术检测这7个多态位点在中、西方猪种远缘群体287个个体中的多态性。连锁不平衡(Linkage Disequilibrium, LD)分析表明大多数SNP位点均存在不同程度的连锁不平衡,但在西方猪种中的LD程度高于中国地方猪种。关联性分析表明：在中国地方猪种中仅2337TC位点与ETEC F41黏附表型显著相关(P0.05)；而在西方猪种中,除c.630AC和c.660TC位点与ETEC F41黏附表型相关性不显著外,其余5个多态位点与ETEC F41黏附表型显著相关(P0.05),表明这些多态位点可能位于ETEC F41受体基因之中或与其处于连锁不平衡状态,这些结果为ETECF41受体基因的精细定位提供了重要的分子标记。 本研究不仅证实了与ETEC F41侵染相关的主效QTL位于猪4号染色体上,而且进一步将目标区域缩小至标记SW2509-KVL2754(5.56 Mb-7.98 Mb)间,为最终确定ETEC F41受体目的基因及其因果突变奠定了重要的前期工作基础。通过对位置候选基因ST3GAL1和ZFAT基因的克隆及多态性分析,鉴别到的与ETEC F41黏附表型显著相关的位点为利用标记辅助选择(MAS)开展抗ETEC F41腹泻病分子遗传育种提供了很好的分子标记。
【关键词】：猪 ETEC F41 易感性 ST3GAL1 ZFAT 关联性
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S852.61
【目录】：
  • 摘要5-7
  • ABSTRACT7-9
  • 目录9-13
  • 第一章 文献综述13-33
  • 1.1 引言13
  • 1.2 大肠杆菌简介13-20
  • 1.2.1 大肠杆菌的特性及种类13-14
  • 1.2.2 大肠杆菌的抗原结构14
  • 1.2.3 大肠杆菌的肠毒素14
  • 1.2.4 大肠杆菌菌毛种类14-16
  • 1.2.5 大肠杆菌的受体16
  • 1.2.6 大肠杆菌的致病机理16-17
  • 1.2.7 猪大肠杆菌性疾病17
  • 1.2.8 仔猪大肠杆菌病的防治17-18
  • 1.2.9 大肠杆菌腹泻病的分子抗病育种的可行性18-20
  • 1.2.9.1 ETEC F4ac分子抗病育种18-19
  • 1.2.9.2 ETEC F18分子抗病育种19-20
  • 1.3 ETEC F41研究进展20-24
  • 1.3.1 ETEC F41流行病学20
  • 1.3.2 ETEC F41黏附素20-21
  • 1.3.3 ETEC F41受体特性21
  • 1.3.4 ETEC F41致病机理21
  • 1.3.5 ETEC F41受体遗传学研究21-24
  • 1.3.5.1 ETEC F41受体的全基因组连锁定位分析22-23
  • 1.3.5.2 ETEC F41受体位置候选基因研究进展23-24
  • 1.3.5.2.1 ST3GAL1基因研究进展23-24
  • 1.3.5.2.2 ZFAT基因研究进展24
  • 1.4 畜禽重要经济性状基因座的定位24-30
  • 1.4.1 畜禽QTL定位的基本方法24-26
  • 1.4.1.1 候选基因法25
  • 1.4.1.2 标记-QTL连锁分析法25-26
  • 1.4.1.3 QTL定位中所使用的模型和统计方法26
  • 1.4.2 畜禽QTL精细定位26-28
  • 1.4.2.1 增加标记密度26-27
  • 1.4.2.2 扩大群体规模27
  • 1.4.2.3 改变实验群体设计27-28
  • 1.4.3 提高QTL精细定位的新策略28-30
  • 1.4.3.1 传递不平衡检验(TDT)定位28-29
  • 1.4.3.2 后裔同源相同IBD定位29
  • 1.4.3.3 连锁不平衡-连锁(LDLA)定位29-30
  • 1.4.3.4 选择性清除效应分析精细定位QTL30
  • 1.5 家畜重要经济性状基因定位的新策略-全基因组关联分析(GWAS)30-32
  • 1.5.1 全基因组关联分析(GWAS)的基本原理30-31
  • 1.5.2 全基因组关联分析(GWAS)的应用31-32
  • 1.5.2.1 GWAS在家畜单基因性状位点定位中的应用31
  • 1.5.2.2 GWAS在家畜多基因控制的复杂性状位点定位中的应用31-32
  • 1.6 本研究的目的和意义32-33
  • 1.6.1 本研究的目的32
  • 1.6.2 本研究的意义32-33
  • 第二章 基于微卫星标记的猪4号染色体ETEC F41受体基因的精细定位33-47
  • 2.1 引言33
  • 2.2 材料与方法33-39
  • 2.2.1 实验动物33-34
  • 2.2.2 黏附表型判定34-35
  • 2.2.2.1 实验菌株34
  • 2.2.2.2 刷状缘的提取34
  • 2.2.2.3 黏附实验34-35
  • 2.2.3 基于微卫星标记的ETEC F41受体基因精细定位35
  • 2.2.3.1 新增微卫星标记的选择35
  • 2.2.3.2 微卫星标记的基因型检测35
  • 2.2.4 总RNA的提取35-36
  • 2.2.5 位置候选基因的空肠组织表达谱分析36-38
  • 2.2.6 统计方法38-39
  • 2.3 结果39-44
  • 2.3.1 ETEC F41黏附表型分布39
  • 2.3.2 微卫星标记基因型检测结果39-40
  • 2.3.3 SSC4上微卫星标记遗传图谱40-41
  • 2.3.4 ETEC F41受体基因精细定位结果41-43
  • 2.3.5 总RNA提取结果43-44
  • 2.3.6 六个位置候选基因的组织表达谱分析44
  • 2.4 分析与讨论44-46
  • 2.5 小结46-47
  • 第三章 利用全基因组高通量SNP标记精细定位ETEC F41受体基因47-59
  • 3.1 引言47
  • 3.2 材料与方法47-50
  • 3.2.1 实验动物47
  • 3.2.2 全基因组芯片扫描47-48
  • 3.2.3 突变位点的基因分型48-50
  • 3.2.4 统计分析50
  • 3.2.4.1 全基因组关联分析50
  • 3.2.4.2 远缘群体中3个多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析50
  • 3.3 结果50-56
  • 3.3.1 ETEC F41黏附表型分布50-51
  • 3.3.2 ETEC F41受体基因全基因组关联分析结果51-53
  • 3.3.3 资源群体强关联位点在远缘群体中基因型检测结果53
  • 3.3.4 目的标记位点在远缘群体中与ETEC F41黏附表型的关联性53-54
  • 3.3.5 目的标记位点的连锁不平衡(LD)分析54-56
  • 3.4 分析与讨论56-58
  • 3.4.1 关于ETEC F41黏附表型在远缘群体中的分布56
  • 3.4.2 关于ETEC F41受体基因全基因组关联分析56-57
  • 3.4.3 关于远缘群体中3个目的标记与ETEC F41黏附表型的关联分析57-58
  • 3.5 小结58-59
  • 第四章 位置候选基因ST3GAL1的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究59-74
  • 4.1 引言59
  • 4.2 材料与方法59-63
  • 4.2.1 实验动物59
  • 4.2.2 ST3GAL1基因全长cDNA的分离59-61
  • 4.2.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别及基因分型61-62
  • 4.2.3.1 ST3GAL1基因多态位点的鉴别61
  • 4.2.3.2 ST3GAL1基因多态位点的基因分型61-62
  • 4.2.4 统计分析62-63
  • 4.3 结果63-71
  • 4.3.1 ETECF41黏附表型分布63
  • 4.3.2 ST3GAL1基因全长cDNA63-65
  • 4.3.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别65-67
  • 4.3.4 ST3GAL1基因多态位点的检测67-68
  • 4.3.4.1 c.284T>A和c.477C>T多态位点的检测结果67
  • 4.3.4.2 c.661A>G多态位点的检测结果67-68
  • 4.3.5 统计分析结果68-71
  • 4.3.5.1 多态位点的连锁不平衡检测68-69
  • 4.3.5.2 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析69-71
  • 4.3.5.2.1 多态位点与资源群体ETEC F41黏附表型的关联性分析69-70
  • 4.3.5.2.2 ST3GAL1基因2个多态位点与远缘群体ETEC F41黏附表型的关联性分析70-71
  • 4.4 分析与讨论71-73
  • 4.5 小结73-74
  • 第五章 位置候选基因ZFAT的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究74-92
  • 5.1 引言74
  • 5.2 材料与方法74-77
  • 5.2.1 实验动物74
  • 5.2.2 总RNA的提取74-75
  • 5.2.3 ZFAT基因全长cDNA的分离75
  • 5.2.4 ZFAT基因多态位点的鉴别及基因分型75-76
  • 5.2.4.1 ZFAT基因多态位点的鉴别75
  • 5.2.4.2 ZFAT基因多态位点的基因分型75-76
  • 5.2.5 统计分析76-77
  • 5.3 结果77-89
  • 5.3.1 总RNA提取结果77-78
  • 5.3.2 ZFAT基因全长cDNA78-82
  • 5.3.3 ZFAT基因多态位点的鉴别及多态性检测82-84
  • 5.3.3.1 ZFAT基因多态位点的鉴别82-84
  • 5.3.3.2 ZFAT基因多态位点的基因分型结果84
  • 5.3.4 统计分析结果84-89
  • 5.3.4.1 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析84-87
  • 5.3.4.2 多态位点的连锁不平衡检测87-89
  • 5.4 分析与讨论89-91
  • 5.4.1 猪ZFAT基因的生物信息学分析89-90
  • 5.4.2 ZFAT基因的多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析90
  • 5.4.3 种群间的连锁不平衡分析90-91
  • 5.5 小结91-92
  • 全文总结与展望92-93
  • 参考文献93-106
  • 附录1 ST3GAL1基因组部分序列106-116
  • 附录2 ST3GAL1基因CDNA序列116-120
  • 附录3 ZFAT基因CDNA序列120-124
  • 附录4 博士研究生学习期间发表的论文情况124-125
  • 致谢125-126

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5 刘鑫;柳小春;蒋隽;黄生强;施启顺;;中外猪种微卫星标记与肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体黏附表型关系的研究[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集（上册）[C];2006年
6 彭健;王劼;程学慧;;预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的研究进展[A];猪营养与饲料研究进展——第四届全国猪营养学术研讨会论文集[C];2003年
7 马永平;罗耀玲;黄雪萍;易发平;宋方洲;;基于双歧杆菌表达系统的ETEC亚单位口服活疫苗研究[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年
8 彭健;王劼;刘振利;黄飞若;;重组菌毛蛋白制备的卵黄抗体在断奶仔猪中应用及效果研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（上册）[C];2009年
9 袁万哲;何孔旺;陆承平;;仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制Ⅳ疫苗生产与免疫效力试验[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（下册）[C];2004年
10 王金洛;徐福洲;杨兵;宋维平;赖平安;;仔猪腹泻多病原特异性卵黄抗体(IgY)治疗和预防剂的研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前8条
1 继;ProdiGene 开始ETEC疫苗的临床试验[N];医药经济报;2002年
2 本报记者 于亮;容量上去了！速度呢？[N];中国计算机报;2005年
3 河北远征药业股份有限公司 杨占礼 马戌平;仔猪白痢病原学研究进展[N];中国畜牧报;2004年
4 本报记者 周培玉 许枫;高技术起点 国际化经营[N];中国企业报;2001年
5 戎文慧；文仪;口服疫苗Dukoral可预防腹泻[N];中国医药报;2004年
6 本报记者 孔丽频;节能车型满足市场低油耗诉求[N];中国改革报;2009年
7 本报记者 孔丽频;省油与安全不再是小型车单选题[N];中国改革报;2009年
8 记者 李婵;人与大肠杆菌：两个世纪的孽缘[N];北京科技报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 卫广森;新生仔猪大肠杆菌性腹泻K_（88）ac-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的研究与应用[D];南京农业大学;2004年
2 王劼;猪源肠毒素大肠杆菌K88ac和F18ac菌毛蛋白基因的表达及其在卵黄抗体生产中的应用[D];华中农业大学;2007年
3 陈书霞;ETEC定居因子CS3对胡萝卜的转化及肠毒素LTB-ST病毒表达载体的构建[D];西北农林科技大学;2003年
4 季华员;猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别[D];江西农业大学;2011年
5 朱晶;产肠毒素大肠杆菌、肠上皮细胞和乳酸菌相互关系的研究[D];上海交通大学;2011年
6 郑继平;肠毒素大肠杆菌口服多价疫苗的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
7 钟世顺;双歧杆菌分泌型粘附素体外调节肠上皮细胞生物学功能的实验研究[D];第一军医大学;2004年
8 张冬梅;肠聚集性大肠杆菌中ybtE基因作用的研究[D];第一军医大学;2001年
9 裴小英;蛋白酶激活受体2在早期断奶仔猪胃肠黏膜屏障中作用研究[D];华中农业大学;2010年
10 姜中其;仔猪断奶腹泻性大肠杆菌的多重耐药性、毒力因子分布及特异性蛋黄抗体药效的研究[D];浙江大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 贾宇静;广州市某医院腹泻病人香港海鸥型菌和ETEC的检测及耐药性分析[D];南方医科大学;2010年
2 黄黎娟;猪ITGB5基因cDNA克隆及其SNPs与ETEC F4ac黏附表型关联性分析[D];江西农业大学;2011年
3 张洋龙;牛源ETEC基因组差异基因的筛选与分析[D];黑龙江八一农垦大学;2014年
4 张雪寒;ETEC肠毒素基因多重PCR检测和热敏肠毒素的克隆与表达[D];南京农业大学;2003年
5 王芳;ETEC肠毒素SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立[D];西北农林科技大学;2011年
6 高菲;表达F4~+ETEC的靶向性乳酸杆菌活菌载体的构建及其免疫原性分析[D];东北农业大学;2013年
7 程学慧;预防仔猪腹泻外源抗体—卵黄抗体研究[D];华中农业大学;2003年
8 赵思俊;复方中药免疫球蛋白生物制剂在初生仔猪血液内动态变化研究及治疗试验观察[D];山西农业大学;2004年
9 许程剑;产肠毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建与表达[D];石河子大学;2006年
10 杨怀谷;猪ETEC F4ac受体编码基因MUC13的拷贝数及其在不同黏附表型个体中的表达分析[D];江西农业大学;2012年
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