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《江西师范大学》 2018年
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超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及机制初探

刘俊  
【摘要】:食品中蛋白质不仅能够提供人体所必需的营养元素,且能提供不同的食物所需的色泽、气味、状态、口感等,蛋白质的这些作用很大程度上取决于蛋白质的功能特性,加工技术对蛋白质功能性质的影响一直是国内外研究的焦点和热点。超声波可促进蛋白质的糖基化反应,但超声前后的糖基化蛋白质结构与功能性质之间的关系、超声波影响糖基化蛋白质功能性质的机制仍然不清楚。因此,研究超声波辅助糖基化修饰对蛋白质功能性质的影响及其机制,可为实现蛋白质的定向改性提供理论支持和技术指导,对提高加工食品营养性具有重要意义。本文以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和α-乳白蛋白(α-Lactalbumin,α-La)为研究对象,采用光谱学、色谱学、质谱学和蛋白质组学等研究方法,对超声波、超声波辅助糖基化修饰处理前后的BSA和α-La结构及功能性质进行测定,分析其改善BSA和α-La功能性质的原因,并从分子水平探索超声波辅助糖基化修饰影响α-La的糖基化特性以及降低α-La致敏性、提高α-La抗氧化能力的内在分子机制,得出以下主要结论:(1)研究不同的超声时间、功率和温度辅助糖基化(半乳糖)修饰对BSA功能性质的影响。结果表明:不同的超声时间、功率和温度辅助糖基化修饰能增加BSA的分子量、降低其内源荧光强度;随超声功率和温度的增加,BSA-半乳糖轭合物的自由氨基酸含量逐渐降低、而接枝度、表面疏水性、乳化能力、热稳定性逐渐升高,随超声时间的延长,其自由氨基酸含量、表面疏水性、乳化能力、热稳定性先增加后减少;此外,随超声功率和时间的增加,BSA-半乳糖轭合物的起泡能力逐渐增加,而随超声温度的升高,其起泡能力先增加后减少;说明超声波预处理辅助糖基化修饰通过改变BSA的结构来改善其功能性质,且不同的超声参数对其功能性质影响较大。(2)研究相同功率的超声波辅助糖基化(互为同分异构体的葡萄糖、半乳糖)修饰对BSA功能性质的影响。结果表明:超声波使BSA的自由氨基酸含量、乳化性和起泡性显著增加;BSA-半乳糖轭合物的分子量、褐变度大于BSA-葡萄糖轭合物的分子量、褐变度,超声波预处理促使其显著增加;BSA-半乳糖轭合物的自由氨基酸含量、内源荧光强度、表面疏水性、乳化性和起泡能力分别低于BSA-葡萄糖轭合物的自由氨基酸含量、内源荧光强度、自由氨基酸含量、内源荧光强度、表面疏水性、乳化性和起泡能力,超声波预处理促使其显著降低;BSA与互为同分异构体的半乳糖、葡萄糖发生糖基化反应,其反应速率为半乳糖葡萄糖,超声波能显著提高其反应速率;说明超声处理和不同构型的糖均能显著影响蛋白质糖基化反应,能改变蛋白质的结构,进一步改善蛋白质的功能性质。(3)以IgG/IgE结合能力为评价指标研究不同超声功率处理的α-La致敏性的变化,揭示超声波对α-La结构及致敏性的影响。结果表明:超声波处理会使α-La致敏性显著增强,随功率的增加,其致敏性逐渐增强;超声波处理不会改变α-La的分子量、也不易使其发生聚合反应;超声波处理会使α-La发生去折叠,同时增加其表面疏水性和α-螺旋含量;ESI-MS揭示α-La可能含有钙离子、丁二酰赖氨酸、乙酰氨基葡糖、N-乙酰神经氨酸四个组分,而超声波处理能影响它们的相对丰度,这些结构的改变导致了α-La致敏性的显著增加。(4)以抑制性ELISA法检测的IgG/IgE结合能力为指标,评价超声波辅助糖基化修饰处理前后α-La致敏性的变化,运用高分辨质谱技术分析其糖基化位点和数量、每个糖基化肽段的糖基化程度(DSP值)。当超声功率为150 W/cm~2时,超声处理α-La-半乳糖混合物后其糖基化位点有7个,且有最高的结合率、DSP值和最低的IgG/IgE结合能力。因此,超声波辅助糖基化修饰降低α-La致敏性的原因主要是通过糖基化位点Lys13、Lys16、Lys58、Lys93和Lys98掩盖α-La的致敏线性表位,和增加α-La的糖基化程度(结合率、糖基化位点和数量、DSP值)。此外,超声波辅助糖基化修饰处理过敏蛋白与单糖的混合物,是一种有效降低α-La致敏性的方法。(5)以ABTS自由基清除能力为指标,评价超声波辅助糖基化修饰处理前后α-La抗氧化能力的变化,并采用高分辨质谱技术分析其结构的变化。结果表明:超声波辅助糖基化修饰能显著降低α-La的内源荧光强度和提高其抗氧化能力;超声波处理会增加α-La糖基化位点,未经超声波处理的α-La有3个糖基化位点发生修饰,而经超声功率60、90、120、150 W/cm~2预处理α-La后其糖基化位点分别增加到了4、4、5、6个;超声波处理提高了所有样品的DSP值。因此,超声波辅助糖基化修饰通过改变α-La空间构象、α-La的肽段及增加α-La的糖基化程度等来提高α-La的抗氧化能力。(6)采用不同超声时间处理α-La,处理后的α-La与甘露糖糖基化反应,分析其糖基化特性(分子量、糖基化位点和数量、糖基化肽段的程度等)的变化。结果表明:不同超声时间预处理辅助糖基化修饰能显著改变α-La的分子量、三级结构;不同超声时间0、5、10、15、20 min预处理α-La后其糖基化位点分别为3、4、4、5、5个。超声波处理使所有样品中糖基化肽段的糖基化程度显著增高。因此,不同超声处理时间辅助糖基化修饰能显著影响α-La的糖基化特性,且超声处理时间的延长对其影响较大。
【学位授予单位】:江西师范大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.21

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