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《山东大学》 2010年
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SATB2基因转染促进钛种植体的骨结合

颜世果  
【摘要】:种植体在临床的应用越来越广泛,除了修复和替代缺失牙齿外,在上下颌骨的整形修复中也被大量使用,种植体治疗已经成为一个标准和常规的程序。 种植体成功的一个重要标志就是形成骨结合,骨结合是在光学显微镜水平观察到的种植体和宿主骨的直接接触形式,此状态下种植体可以承受压力并行使功能。骨结合一个重要的前提条件就是种植体周围新骨的生成。但是在种植体植入后,种植体周围骨再生相对比较慢。而且在初始愈合期以后,由于种植体周围新形成骨的骨密度比较低,种植体周围的骨组织对种植体的支持有限,因此对种植体骨结合的研究依然面临很大的挑战。很多的基础和临床研究致力于如何通过缩短种植体骨结合的时间来缩短治疗周期,提高治疗的效率。为了实现这个目标,最常见的方法就是通过改变种植体的设计参数来实现,这些改变包括种植体的材料,种植体外形的修改以及种植体表面的修饰。目前认为,种植体的骨结合是通过成骨细胞的活动来完成的,大部分对种植体表面的修饰都是为了促进或者改善种植体周围组织中细胞对种植体的反应。除了通过对种植体表面的修改来促进种植体的骨结合,也有一些通过系统或者局部应用与成骨相关的转录因子或者生长因子增加骨-种植体的结合。Satb2是近几年来发现的在成骨细胞的分化以及牙和颅颌面发育中起重要重要作用的转录因子。Satb2可以与成骨分化相关的重要调控转录因子Runx2、Osx以及Atf4等协同作用,提高其在骨骼发育及成骨细胞分化中的调节作用,并可以直接结合于成骨细胞特异性基因BSP和OCN的启动子促进BSP和OCN的表达,另外,Satb2可以下调成骨细胞中抑制骨形成的Hoxa2的表达而促进成骨细胞的分化和成骨。Satb2基因敲除鼠的胚胎显示多发的颅颌面缺陷,包括下颌骨明显的短小,鼻骨和上颌骨的发育不足,舌骨的畸形以及腭裂,且基因敲除小鼠一般在出生后立即死亡,在对Satb2基因敲除鼠的成骨细胞的研究中发现:其成骨细胞的分化和功能存在缺陷,骨的形成和钙化延迟,基质中胶原的表达显著降低,在细胞外基质的沉积中存在明显的缺陷。研究者认为,Satb2在成骨细胞的分化以及颅颌面的发育中是一个重要的骨发育性调节分子,是骨骼发育以及成骨细胞分化的基因调控系统中的分子枢纽。因此有理由相信,Satb2在骨形成及骨重建中起到重要的调节作用,是未来骨修复和骨组织工程中理想的候选因子。 因此本实验纳入Satb2作为研究对象,采用RCAS或pBABE-Hygro两种不同的逆转录病毒系统,以基因转染的方法将Satb2过表达于植入BSP-TVA转基因小鼠中的种植体周围,观察Satb2局部高表达在种植体周围成骨及骨结合中的作用。这两种不同的病毒表达载体感染BSP-TVA转基因小鼠的细胞不同。其中RCAS逆转录病毒表达系统可以使编码Satb2的病毒RCAS-Satb2特异性感染种植体周围组织中BSP阳性的细胞,而pBABE-Hygro-Satb2逆转录病毒表达系统可以感染种植体周围所有分裂期细胞。通过检测两组结果的异同,可进一步了解不同细胞参与种植体周围组织的成骨是否存在差异。同时,采用局部使用高表达Satb2骨髓基质细胞的办法,检测局部使用Satb2基因转染的骨髓基质细胞在种植体骨结合中的作用。从而探讨Satb2基因治疗促进种植体骨结合的效果及基因转染方式。 材料和方法: 第一部分:本实验纳入了研究成骨的理想的动物模型:BSP-TVA转基因小鼠。该转基因小鼠利用独特的RCAS-TVA系统,通过4.9kb的BSP启动子控制TVA基因的表达,使TVA基因选择性表达在成骨细胞中,表达TVA的分裂期哺乳细胞可以很容易被RCAS感染。成功构建RCAS-Satb2逆转录表达载体。在种植体植入BSP-TVA小鼠的股骨的远心端前,将含有108cfu/ml的编码Satb2或者RCAS空载体的逆转录病毒3μl注入种植体窝。术后1周及3周取材,通过HE染色观察种植体周围组织的成骨情况,采用HE染色、BSP免疫组化染色和组织学测量评价Satb2高表达在种植体的愈合及骨结合中的作用。同时对术后1周及3周种植体上下1mm范围的骨组织提取RNA后,通过Real-time RT-PCR检测组织中Satb2及成骨相关基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表达情况,观察Satb2在实验组和对照组组织中的变化。 第二部分:实验采用了另外一个不同的病毒表达系统,pBABE-Hygro逆转录病毒表达载体系统。在成功包装pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro病毒并将病毒滴度调整到108cfu/ml后,我们采用与第一部分相同的手术方法及检测方法对pBABE-Hygro-Satb2促进种植体骨结合的作用进行了检测。 第三部分:应用pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro逆转录病毒体外感染EGFP标记的BMSCs,检测感染后2天,9天及23天的BMSCs中Satb2及成骨相关基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表达。将感染后48小时的BMSCs细胞悬液局部应用于B6D2F1小鼠股骨的种植体部位,采用与第一部分相同的实验方法对超表达Satb2的BMSCs在种植体的骨结合中的作用进行检测。同时用GFP免疫组化染色的方法追踪外源性的BMSCs在组织中的去向及功能。 结果: 第一部分:局部使用RCAS及RCAS-Satb2病毒,术后1周,HE染色结果显示:种植体周围有新形成的编织骨;与种植体直接接触的宿主组织中,活化的成骨样细胞排列规律,呈复层围绕种植体;周围组织中还有一些炎症细胞的浸润。实验组中种植体周围的骨面积百分比(% bone area)高于对照组,但差异无显著性。实验组中,与种植体直接接触的宿主组织已有30%左右与种植体形成骨结合,可见处于活跃期的成骨细胞,实验组中宿主与种植体发生骨结合的区域是对照组2倍。采用Real-time RT-PCR技术对种植体周围1mm范围内成骨相关基因的检测结果发现:实验组中Satb2的表达增加约3倍,Osx, Runx2, BSP, COLI和OC的表达也显著增加。而BSP免疫组化结果与实时定量检测BSP的结果一致,实验组中BSP的阳性细胞数和间质中BSP的信号都高于对照组。 术后3周,种植体被大量的骨组织包绕,与种植体直接接触的部位,有编织骨及板层骨,周围的组织中已经没有明显的炎症。HE染色组织测量结果显示:3周时,实验组中种植体周围的骨面积百分比高于对照组,宿主组织与种植体之间的结合主要为骨结合,实验组中与种植体直接接触的宿主组织已有80%左右与种植体形成骨结合,实验组中骨结合区域的比例是对照组的1.4倍。同时检测了3周时,种植体周围1mm范围内Satb2及成骨相关基因的表达,实验组中Satb2, Osx, Runx2, BSP, COLI和OC的表达均略高于对照组,但差异均无显著性。而BSP免疫组化的计数结果在实验组和对照组也无显著差异。 第二部分:局部使用pBABE-Hygro及pBABE-Hygro-Satb2逆转录病毒,术后1周,HE染色结果显示:种植体周围出现新形成的编织骨,与种植体直接接触的部位,活化的成骨样细胞排列规律整齐,呈复层围绕种植体,周围的组织中可见少量的炎症细胞浸润。实验组中种植体周围的骨面积百分比高于对照组。与种植体直接接触的宿主组织已有10%左右与种植体形成骨结合,实验组中宿主与种植体发生骨结合的区域大于对照组,但差异无显著性。Real-time RT-PCR结果显示:术后1周,实验组中Satb2的表达增加约2倍,成骨相关的转录因子Osx和Runx2,及成骨特异性基因BSP及COLI表达显著增加;而OC的表达虽然有增加,但与对照组相比差异没有显著性。实验组BSP阳性细胞数高于对照组。 术后3周,HE染色结果显示,种植体主要被骨组织包绕,与种植体直接接触的部位,主要为不同形态的骨组织,实验组中种植体周围的骨组织是排列规则的板层骨及少量的编织骨,与种植体直接接触的区域也是矿化良好的骨组织;对照组中,与种植体直接接触的骨组织中,局部有未完全矿化的细胞成分存在。3周时,实验组中种植体周围骨面积百分比高于对照组,宿主组织与种植体之间的结合主要为骨结合,实验组中宿主与种植体发生骨结合的区域是对照组的约1.6倍。种植体植入3周时,实验组中Satb2的表达仍显著高于对照组,实验组中成骨相关的转录因子Osx, Runx2及与成骨密切相关的BSP, COLI, OC的基因表达均明显增加,与对照组相比差异具有显著性。实验组中BSP的阳性细胞数高于对照组。 第三部分:1周时,GFP阳性的BMSCs分散位于种植体周围的组织中,分布不均匀;3周时,在种植体周围仍然可以检测到GFP阳性的BMSCs存在;Satb2过表达的BMSCs在3周时促进了种植体的骨结合,并促进了种植体周围新骨的形成。体内外Real-time RT-PCR结果基本一致,在3周时,种植体周围组织中Satb2及成骨相关基因的表达仍然高于对照组,与第二部分3周时的结果相一致。 结论: 1.局部使用RCAS或pBABE-Hygro两种不同的逆转录病毒表达系统,均可以以基因转染的方法将Satb2转入BSP-TVA转基因小鼠股骨种植体周围组织中,并在种植体的局部高表达Satb2。 2. Satb2在种植体局部的高表达能够促进种植体部位组织中成骨相关转录因子Osx和Runx2的表达,同时提高了成骨特异性基因BSP, COLI及OC的表达;使用RCAS-Satb2逆转录病毒时,能够显著提高种植体1周时的骨结合;3周时,Satb2促进了种植体的骨结合并促进了种植体周围新骨的形成。 3.通过RCAS及pBABE-Hygro两种不同的逆转录病毒表达系统将Satb2应用于种植体的局部在种植体周围组织的成骨机制中存在明显的差异。两组在种植体周围组织中成骨机制的差异,可能与RCAS逆转录病毒表达系统只能感染表达TVA的细胞,而pBABE-Hygro逆转录表达系统能够感染所有分裂期细胞,从而使感染了pBABE-Hygro-Satb2的细胞尤其是具有多向分化潜能的干细胞更积极地参与到种植体周围的成骨和骨重建中有关。 4.体外感染pBABE-Hygro-Satb2的BMSCs在第2、9及23天高表达Satb2,高表达Satb2的BMSCs局部应用于种植体部位能够促进种植体周围新骨的形成并促进种植体的骨结合。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R783

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