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《山东大学》 2010年
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神经病理性疼痛模型大鼠延髓腹后内侧核NF-κB及下游炎性因子表达的研究

丛木林  
【摘要】:研究背景 椎间盘源性疼痛是慢性腰背痛的一个主要原因,慢性腰背痛是由于椎间盘内部结构髓核的紊乱和纤维环出现裂隙,髓核漏出到外层纤维环而导致的。而导致疼痛的炎性机制越来越受到人们的重视。在炎症机制里参与的各种细胞因子在疼痛的发生、发展中起着怎样的作用,应如何利用这些细胞因子来治疗疼痛,引起了广泛的研究。 目前已知核转录因子-kappa B (NF-κB)信号转导通路参与调控神经病理性疼痛中多种炎症介质的表达,加剧炎症反应,引起疼痛。多种炎症介质受NF-κB信号转导通路的调控,使炎性因子的表达显著增加,如白细胞介素-6(IL-6)一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMPS)、前列腺素-2 (PGE22)、磷脂酶-2 (PLA-2)等。有研究报导了在背根神经节和脊髓背角处的NF-κB信号传导通路在疼痛发生时被激活的情况。 但这些研究均采用结扎坐骨神经或腰神经根的方法来构建实验动物模型,与椎间盘源性疼痛产生的病理生理机制不尽相同。我们模拟临床椎间盘源性疼痛的病理形式建立了一个新的椎间盘疼痛动物模型,并研究在该模型下研究延髓腹内侧核神经元中NF-κB及下游炎症介质的变化情况。尽管Kawakami等率先采用了该模型研究自体髓核导致的椎间盘性疼痛,但目前仅局限于腰神经根和背根神经节水平。 目前已知延髓头端腹内侧核群(RVM),它接受前额叶皮层、下丘脑、中央导水管周围灰质(PAG)和臂旁核等结构的传入,其传出纤维主要经过脊髓背外侧束和腹外侧束下行到达脊髓背角,参与疼痛通路的传递。在慢性疼痛状态下,RVM被认为参与调节下行激动系统。NF-κB认为是调节炎性因子表达的重要转录信号之一,例如在慢性炎性疼痛中刻意调节白介素6(IL-6)的表达。但对于该模型下延髓腹内侧核群的神经元是否参与炎症机制还缺乏深入的研究。 目的 本实验将着眼于研究椎间盘退变引起的神经病理性疼痛的诱因,即椎间盘退变,髓核诱发机体免疫反应;产生疼痛时内部的炎症介质表达情况的变化;以及疼痛感觉传导通路的中继核团参与调控的情况加以研究。本实验研究探讨延髓头端腹内侧核团及脊髓背角中NF-κB及下游炎性因子IL-6参与疼痛的调控机制,以期寻找为神经病理性疼痛的预防和治疗提供新的方法和途径。 方法 1.神经病理性疼痛模型的建立与分组:56只成年雄性SD大鼠随机分为两组:手术组和假手术组,手术组取自体尾椎纤维环碎块置于右侧第4、5腰神经根前内侧、髓核涂于表面,假手术组仅暴露神经根,不做处理。术前及术后1、4、7、14、28天分别测定双侧后肢足底的机械痛阈和热痛阈。 2.免疫组织化学(IHC)测定:心脏灌注后,取材,切片,备用。IHC测定各组组织中NF-κB和炎性因子的表达差异,应用TJTY-400TC彩色细胞图像分析仪对各组切片随机抽取的20个不相互重叠的视野进行分析,计算NF-κBp65和IL-6免疫反应阳性细胞数。 3. Western-blot:测量痛阈完成后,处死大鼠。置于生理盐水冰块上取出延髓节段,剪除周围组织,保留RVM部分备用。采用UNSCAN-IT生物电泳图像分析系统对Western印迹显示的免疫反应阳性条带进行吸光度测定,以NF-kappa B和β-actin条带的吸光度的比值代表NF-kappa B表达的相对水平。 4.统计学处理:用SPSS13.0分析软件进行数据处理,当P0.05时认为差异具有统计学意义。 结果 1.各组痛阈的变化:术前各组大鼠机械痛阈和热痛阈值的比较无统计学意义。术后第1-3 d,两组大鼠的热痛和机械痛阈值无明显差异。手术组:患侧在第4天阈值降低(P.05),第7天达到峰值与Sham组比较(P.05),7d后开始逐渐恢复,持续到第28天(P.05)。手术组内同一大鼠左右侧比较在术后4d、7d、14d,有显著性差异(P.05)。假手术组内左右两侧术前术后痛阈的比较均无统计学差异。 2. Western-blot测定结果:手术组,NF-kappa B的表达在4d开始增高,术后第7天达到最高值,然后开始降低,持续到28天。假手术组各时间点则没有明显变化.两组在术后各时间点的表达存在显著性差异(P.05)。鞘内给药后,PDTC+手术组NF-kappa B表达量显著降低,较未给药组存在显著性差异(P.05)。 3.免疫组化测定结果:假手术组阳性细胞较少,而手术组阳性细胞则明显增多(P.05),炎症因子IL-6也出现相同表达趋势。 结论 1.本研究构建的动物模型能够诱发与临床相似的神经病理性疼痛,测量结果重复性较好。 2. NF-κB信号通路在炎性疼痛中发挥重要作用,并调控炎性因子的表达。提示NF-κB信号通路及其下游促炎性细胞因子可能参与神经病理性疼痛的调节。 3.延髓腹后内侧核作为中继核团参与神经病理性疼痛的传导过程,提示NF-κB抑制剂可以控制核团内神经元疼痛信号的传导。 目的 本实验通过鞘内给药PDTC抑制NF-κB的表达,研究观察延髓头端腹内侧核团及脊髓背角神经元中NF-κB及下游炎性因子IL-6的水平变化,明确NF-κB在疼痛调节中的作用。 方法 1.鞘内置管与分组:麻醉后,暴露寰枕膜,PE-10号导管置入,可见脑脊液沿导管涌出视为置管成功。固定导管并缝合伤口。剔除出现运动功能障碍的大鼠。术后分笼饲养,5d后即可用于下一步实验。选取置管成功的大鼠32只,分为手术+生理盐水组、手术+PDTC组、假手术+生理盐水、假手术+PDTC组。 2.建模:鞘内注药后,第二天进行疼痛模型或假手术模型的建模。术前和术后每天在给药前进行机械痛阈及热痛阈的测量。连续注药7天后,处死大鼠后取材,进行指标检测。 3.免疫组织化学(IHC)测定:给药7天后处死大鼠,心脏灌注后,取材,切片。IHC测定各组组织中NF-κB和炎性因子的表达差异,并观察PDTC对NF-κB表达的影响。 4. Western-blot:采用UNSCAN-IT生物电泳图像分析系统对Western印迹显示的免疫反应阳性条带进行吸光度测定,以NF-kappa B和β-actin条带的吸光度的比值代表NF-kappa B表达的相对水平。 5.统计学处理:用SPSS13.0分析软件进行数据处理,当P0.05时认为差异具有统计学意义。 结果 1.鞘内给药PDTC后,手术+PDTC组的痛阈值较手术+生理盐水组增高,有统计学差异(P.05)。假手术+生理盐水组与假手术+PDTC组的痛阈值相比较,无显著性差异(P.05)。 2. Western-blot测定结果:鞘内给药后,PDTC+手术组NF-kappa B表达量显著降低,较未给药组存在显著性差异(P.05)。 3.免疫组化测定结果:PDTC+手术组阳性细胞较单纯手术组明显增多(P.05)。PDTC+假手术组和假手术组+生理盐水组则无明显变化。炎症因子IL-6也出现相同表达趋势。 结论 1.鞘内给药安全可靠,可以持续、定时给药。 2.鞘内注射PDTC可显著抑制神经病理性疼痛。 3. PDTC可以抑制NF-κB的激活,降低RVM、脊髓背角区域促炎性细胞因子IL-6的表达,提示NF-κB信号通路及其下游促炎性细胞因子可能参与神经病理性疼痛的调节。 4.阻断NF-κB信号转导通路的激活可能是防治神经病理性疼痛的有效辅助手段之一 目的 通过对单纯髓核摘除术与椎间盘切除术+椎体间融合+椎弓根内固定术两种手术方式的术后生活质量进行分析,比较两种手术方式治疗腰椎间盘突出症的优缺点。 方法 依据选择标准收集82例腰椎间盘突出症患者。患者年龄在35-67岁之间(44.6±10.4岁),男49例,女33例。只选择突出节段为L4/5或L5/S1的单节段突出患者,其中在L4/5节段44例,L5/S1节段38例。单纯髓核摘除组44例(年龄42.2±8.5岁),融合固定组38例(年龄46.8±10.8岁)。分别采用单纯髓核摘除术和椎间盘切除术结合椎体间融合内固定术。术后根据JOA评分和ODI指数对治疗效果进行评估,同时计算术前术后JOA评分与椎间隙高度变化的关系。并比较单纯组JOA评分与术后椎间隙高度丢失之间的关系。使用SPSS统计软件进行分析,P0.05认为有统计学意义。 结果 根据JOA评分和ODI指数,单纯摘除组与融合固定组术后缓解明显,手术前后的比较有显著性差异(P0.05)。两组在术前及术后各时间点的比较则无显著性差异(P0.05)。两组手术前后椎间隙高度变化以变化率来表示,单纯摘除组椎间隙高度变化率术前、术后无显著性差异(P0.05);融合固定组术前、术后存在统计学意义(P0.05)。根据椎间盘高度比值分成小于75%和大于75%--组,椎间盘高度率75%的病人JOA评分明显高于椎间盘高度率75%的病人,两组之间存在显著性差异(Student t检验,P0.05)。提示椎间盘退变后间隙高度丢失的程度与术后疗效密切相关。 结论 1.单纯髓核摘除术和椎间盘切除融合内固定术在短期随访过程中均取得满意的治疗效果,两者在术后临床症状方面无显著性差异。 2.单纯髓核摘除术术后椎间隙丢失程度与临床症状有相关性。 3.单纯髓核摘除术术后有较高的复发率。 4.对于腰椎间盘突出症患者的手术方式的选择应该严格按照治疗原则选定,避免过度融合。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R681.5

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