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《山东大学》 2010年
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岩白菜素的人体与动物药代动力学及对I_(GABA)的作用研究

王进  
【摘要】:目的: 创建灵敏度高、特异性强的,适合岩白菜素体内药代动力学研究的液相色谱-二级质谱联用(HPLC-MS/MS)生物样本浓度测定方法。 建立灵敏度高、专属性强、方便可行的高效液相色谱法(HPLC)并且首次测定昆明种(KM)小鼠血浆及组织中岩白菜素浓度,评价岩白菜素在健康小鼠体内的吸收、分布、代谢、排泄过程。 采用建立的HPLC-MS/MS血药测定方法首次进行口服岩白菜素后人体药代动力学研究。进行中国健康志愿者单次单剂量口服岩白菜素(250mg)的药代动力学研究,了解其人体吸收、分布、消除体内过程规律。为制定科学合理的岩白菜素临床给药方案和深入的药效机制研究提供依据。 建立高灵敏度和精确度、专属性强的液相色谱——级质谱联用(HPLC-MS)血药浓度测定方法。并对健康志愿者单次单剂量口服复方岩白菜素片(岩白菜素与马来酸氯苯那敏)中小剂量联用的氯苯那敏(4mg)进行人体药代动力学规律研究。 应用膜片钳技术记录岩白菜素对大鼠海马中枢神经元和GABAA受体转染的HEK293细胞膜上Y-氨基丁酸(GABA)-激活电流(IGABA)的调制作用,同时对比岩白菜素对谷氨酸(Glu)-激活电流(IGLU)的影响,分析研究岩白菜素的中枢镇咳作用的可能分子作用靶点和机制。 应用膜片钳记录分析岩白菜素对GABAA受体介导的IGABA的量效关系及电压-电流(I-V)曲线,分析其作用特点和规律。 试采用液相色谱和质谱法及膜片钳等技术多方面分析研究岩白菜素的药代动力学规律和药效学主要作用机制,为新药开发和中药有效化合物研究提供较新的系统思路。 方法: 岩白菜素(1)色谱条件:采用Agilent SB-C18 (50mm×2.1mm,3.5μm)色谱柱;流动相为乙腈:水(10:90,V/V),在线脱气;流速0.2ml·min-1;柱温20℃;检测波长250nm;进样量20μl。(2)质谱条件:ESI离子源,负离子模式,雾化压力40 psi,干燥气(N2)流速9 L·min-1,干燥气温度为350℃,毛细管电压4000V,多级反应监测(MRM)方式,m/z:327.1→192(岩白菜素),m/z:354→185.1(内标),碰撞能量15V(岩白菜素)和30V(内标),碎片电压为100V。 氯苯那敏(1)色谱条件:Venusil XBP-C18(5μm, ID4.6×150mm)色谱柱;流动相为甲醇:0.005M醋酸铵溶液(60:40,V/V),0.40μm微孔滤膜过滤,在线脱气;流速0.8ml·min-1;柱温25℃;进样量10μl。(2)质谱条件:API-ES离子源,正离子模式,喷雾气(N2)压力50psig,干燥气(N2)流速13.0L·min-1,干燥气温度350℃,毛细管电压4000V,选择性监测质荷比(m/z)为275.1(氯苯那敏)和256.1(苯海拉明)的分子离子峰,碎片电压分别为90V和70V。 样本处理:(1)岩白菜素取血浆样品0.5ml,加入400ng·mL-1甲砜霉素内标溶液20μL,涡旋混匀,加4ml提取液(乙酸乙酯),涡旋混合1min,5000 r·min-1离心5min,取上层萃取液3.5ml,于40℃水浴N2吹干,残渣用100 u l流动相溶解,进样20μL。(2)氯苯那敏取血浆0.5ml,加入200ng·mL-1的苯海拉明内标溶液50u l,混匀,加入5ml氯仿,涡旋混匀2min,4000rpm离心5min,吸取下层有机相4ml,40℃水浴N2吹干,残渣用100μl流动相复溶。 20名健康志愿者,于试验前一天晚禁食,试验当日晨抽取空白血样后,立即空腹口服复方岩白菜素试验制剂(250mg岩白菜素+4mg氯苯那敏)。不同时间取血,采用HPLC-MS/MS法和HPLC-MS法检测血浆中岩白菜素原型和氯苯那敏的浓度变化,采用DAS2.0实用药代动力学程序计算其药代动力学参数,分析其药代动力学特点。同期观察不良反应。 昆明种小鼠104只,岩白菜素尾静脉注射给药3mg·kg-1后静脉取血及解剖取小鼠的心、肝、脾、肾、小肠、肺、脑,HPLC法测定其浓度或组织含量变化,评价小鼠体内的药代动力学及组织分布特征参数。 应用全细胞式膜片钳技术和外膜外向式单通道技术,记录岩白菜素对大鼠海马中枢神经元和GABAA受体转染的HEK293细胞膜上ICABA的调制作用,并记录其剂量-效应变化和I-V曲线,分析作用特点。同时采用全细胞模式记录观察岩白菜素对IGLU的影响。分析岩白菜素的中枢镇咳作用的可能机制。 结果: 本实验创建的岩白菜素体内测定HPLC-MS/MS方法灵敏度高,专属性强,方便可行。岩白菜素在0.25~60ng·ml-1范围内线性关系良好,最低定量限可达0.25ng-mL-1,成功测定出岩白菜素主要人体药代动力学参数:t1/2为2.850±1.823h,Tmax为1.725±0.638h,AUC0~12为49.013±14.613ng·ml-1·h, Cmax为15.216±5.023ng·ml-1, AUC0~∞为51.352±15.194 ng·ml-1·h。 HPLC-MS方法测定氯苯那敏的定量下限可达0.2ng·ml-1,氯苯那敏在0.2~20ng·ml-1范围内线性关系良好。联用的小剂量氯苯那敏在口服复方岩白菜素片后人体内主要药代动力学参数:血药浓度达峰值Tmax为2.650±0.763h,t1/2为11.480±3.605h, AUC0~36为98.636±22.863ng·ml-1·h, AUC0~∞为113.173±32.390ng·ml-1·h, Cmax为6.636±1.533ng·ml-1。 小鼠静脉注射岩白菜素后体内药代动力学参数:t1/2为1.16±0.03 h, Cmax为2443.3±557.6 mg·L-1, AUC0-8为2482.6±281.4 mg·ml-1·h,AUC0-∞为2482.9±331.0mg·ml-1·h, Vd为1.07±0.08 L·kg-1。岩白菜素经静脉给药后,很快分布于全身,在体内组织分布广泛,代谢快。在动物体内主要分布于血液、肝脏和肾脏组织,其他组织中含量较少,但脑中含量相对肺组织较高。 大鼠海马中枢神经元和转染GABAA受体的HEK细胞对外加GABA敏感。神经元上此GABA激活电流可被特异性GABAA受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline)所完全阻断。岩白菜素可明显增强GABA诱导的突触后抑制性电流IGABA。0.02-10mmoL·L-1岩白菜素对IGABA增强有浓度依赖性变化,量效曲线呈“s”型且EC50为0.81mmol·L-1。加入岩白菜素后GABA量效曲线可明显上移,但IGABA的最大值在加入岩白菜素前后基本不变。单通道记录发现岩白菜素对GABAA受体的影响主要是受体门控性通道的开放概率增加。此外,海马神经元同时给予50μmol·L-1 Glu和1mmol·L-1岩白菜素,IGlu在加入岩白菜素前后无明显改变(P0.05)。 结论: 创建报道的岩白菜素体内测定HPLC-MS/MS方法灵敏度高,专属性强,方便可行。岩白菜素在0.25-60ng·ml-1范围内线性关系良好,最低定量限可达0.25ng.mL-1。健康志愿者口服岩白菜素250mg后达峰时间短,吸收迅速,半衰期不长显示人体内消除速度较快。药代动力学特点符合二室模型。 建立的HPLC-MS方法测定氯苯那敏定量下限可达0.2ng·mL-1,氯苯那敏在0.2-20ng·ml-1范围内线性关系良好。可很好的检测复方给药后血药浓度很低的氯苯那敏。也可用于单方及其它剂型的检测。口服该药后吸收较快且完全,比岩白菜素半衰期长可在体内停留较长时间。 小鼠静脉给药后岩白菜素的半衰期短,分布广泛,其中肝脏肾脏分布高,说明岩白菜素消除代谢快,发现脑组织相对肺组织含量高,可能与中枢性镇咳有关。 岩白菜素能够增强突触后抑制性电流IGABA;且岩白菜素自身无法激活IGABA,与GABA合用可使GABAA受体开放的概率增加,从而增强IGABA。说明岩白菜素可能提高GABA和GABAA受体的亲和力来增强IGABA。岩白菜素对IGLU无影响。提示岩白菜素中枢镇咳作用的分子作用机制可能与GABA密切相关。 岩白菜素和氯苯那敏安全性高,实验期间未见不良反应发生。 启示: 液相色谱-质谱法和膜片钳技术综合应用联合运用现代先进检测技术,对新药或中药有效化合物的药代动力学和药效学机制综合评价有重要意义。 岩白菜素的镇咳及相关作用机制研究进一步研究岩白菜素对GABA等各类受体的作用和体内外实验效应,可探究岩白菜素类镇咳等主要作用的分子作用机制,为指导临床应用和开发新药提供明确的理论依据。 进行岩白菜素体内代谢过程及代谢产物相关研究进一步对岩白菜素生物体内转化过程,代谢产物及其活性进行更详尽的研究,有利于明确岩白菜素类的全面作用规律和机制。 开发岩白菜素靶向制剂开发在呼吸中枢部位高分布的岩白菜素靶向制剂,减少在肝脏肾脏组织的分布有助于提高其治疗作用。
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