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《山东大学》 2010年
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川西獐牙菜体细胞杂交及其环烯醚萜类化合物合成相关基因香叶醇-10羟化酶的克隆和功能验证

王俊峰  
【摘要】:中药材有效成分的绝大多数都来源于次生代谢产物,利用细胞工程(体细胞杂交)及次生代谢的基因工程,来改良中药材品质的研究具有重要意义。 体细胞杂交可转移并提高药效成分含量,实现药用成分合成基因在不同科、属、种间的相互转移,获得含有高含量异源药效成分的体细胞杂种。目前有关中药材体细胞杂交研究已有一些成功的例证,其中狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交已获得杂种植株(向凤宁等,2003),但是杂种中异源染色体/DNA的存在方式、异源有效成分合成相关基因表达与异源有效成分积累的相关性尚未进行深入分析。 次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。通过超量表达相关限速酶基因,来提高目标代谢物产量是植物代谢工程的主要策略之一。目前在基因水平上萜类合成途径研究较为清楚,单萜类代谢途径中的一些基因已被克隆,但有关中药材有效成分合成相关基因的发掘才刚刚开始。 高寒藏药材——川西獐牙菜(Swertia mussotii Franch)专治黄胆性肝炎及病毒性肝炎,野生资源匮乏。其主要有效成分为芒果苷、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷。 獐牙菜苦苷(swertiamarin)和龙胆苦苷(gentiopicroside)属于环烯醚萜类(iridoid)化合物,它们的生物合成途径尚未完全已知。,香叶醇(geraniol)是环烯醚萜类化合物(iridoid)生物合成途径的重要组分,它的氧化被认为是烯醚萜类化合物合成途径中第一个限速步骤,此反应由香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase, G10H)催化香叶醇而生成10羟基-香叶醇(10-hydroxygeraniol)。 本论文开展了狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交研究,获得了体细胞杂种再生植株;分析了不同杂种中的药效成分含量;比较了川西獐牙菜(供体)染色体、核基因组DNA及SmG10H基因在不同杂种细胞系中的差异;初步确定了杂种中供体核基因组组成及SmG10H基因表达模式与异源药效成分含量的关系。探讨了UV剂量对杂种生长、染色体消减和片段化的影响。 通过狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种及双亲细胞色素P450(cytochrome P450)基因片段序列分析,发现了杂种中存在一个与川西獐牙菜香叶醇-10羟化酶(G10H)基因同源的片段。在此基础上,首次分离了川西獐牙菜的香叶醇-10羟化酶的全长新基因(SmGl0H);分析了在诱导子茉莉酸甲酯(MeJA)处理下,环烯醚萜类化合物代谢途径中相关酶基因表达水平的差异及其与药效成分积累的关系。完成了SmG10H在原核大肠杆菌、真核酵母中的功能验证及酶活力测定;实现了SmG10H对川西獐牙菜胚性愈伤组织的转化,获得了獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量高的转基因植株,为进一步研究转基因植株及后代环烯醚萜类化合物代谢的分子机制奠定了基础。 主要研究过程及实验结果包括: 1.狭叶柴胡与川西獐牙菜体细胞杂交 1.1体细胞杂种细胞系及其再生植株的获得 以高寒藏药材川西獐牙菜原生质体为供体,经380μW/cm2的紫外线照射0sec、30 sec、1 min、2 min和3 min后,与狭叶柴胡原生质体(受体)在PEG诱导下进行融合,共产生194块愈伤组织,其中,3个克隆再生出完整绿苗,并移栽成活。经染色体和同工酶分析,证明了104个细胞系的杂种性质。 1.2体细胞杂种核基因组组成分析 1.2.1杂种染色体和GISH分析 双亲染色体数目:狭叶柴胡愈伤组织染色体数目为11-12条,川西獐牙菜愈伤组织染色体数目为17-20条,杂种染色体数目为11-20条。 GISH结果显示:杂种细胞系B24(具有分化能力,可再生植株)和C10(无分化能力)中狭叶柴胡染色体均为11-13,完整川西獐牙菜染色体及其染色体小片段数目分别为:0-3/1-3和0-1/5-9。表明,随UV-射线剂量的增加,完整川西獐牙菜染色体数目逐渐减少,供体染色体小片段数目增加,证明了UV剂量在杂种川西獐牙菜染色体消减及片段化中的作用。 1.2.2 RAPD分析 200个随机引物的PCR扩增分析表明:1)杂种细胞系均含有双亲特征谱带或新带;2)杂种中保留了91.2%-96.0%的狭叶柴胡DNA谱带、0.2%-2.6%的川西獐牙菜供体DNA谱带。表明体细胞杂种的核基因组以受体狭叶柴胡为主,受体对杂种的核基因组贡献大于供体;3)除C10外,不同杂种的供体带比例及新带比例差别较小,表明杂种中供体DNA组成相近;4)杂种中供体DNA和重组DNA含量与紫外照射的时间成正相关。 1.3体细胞杂种中药效成分含量及醇溶性成分的代谢谱变化分析 HPLC测定发现,所有的74个杂种细胞系中均不含有龙胆苦苷,杂种B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124含有獐牙菜苦苷(含量为0.0074-0.0812 mg/g),杂种克隆B6、B40、B56、C10和C121仅含芒果苷(含量为0.0863-0.8168 mg/g),其中,B6、B56和C10含量高于亲本川西獐牙菜(0.6641 mg/g),表明,供体川西獐牙菜的獐牙菜苦苷和芒果苷已转入受体狭叶柴胡中。GC-MS分析表明,杂种中含有大部分柴胡(受体)的特征性物质,少量的川西獐牙菜特征性物质及非双亲物质(新物质)。1.4细胞色素P450基因在杂种及双亲中的存在方式 利用CYP76的简并引物对川西獐牙菜、狭叶柴胡及其体细胞杂种细胞系A6、A67、B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124进行了RT-PCR扩增,获得了11个长度约1100-1200bp的G1OH基因的同源片段。基因片段序列比对发现,狭叶柴胡的G10H与川西獐牙菜的同源性为45.7%;杂种B24、B27、B132、C18、C26、C47和C124的G1OH与川西獐牙菜(SmG1OH)的完全相同,表明它们可能来源于供体川西獐牙菜。杂种A6、A67的G10H与狭叶柴胡的同源性(84.1%)远高于与川西獐牙菜的同源性(53.1%),表明,该基因片段可能来源于狭叶柴胡。研究表明,G1OH除了参与吲哚生物碱的合成,亦可能参与了环烯醚萜类代谢合成,而抗肝炎药效成分獐牙菜苦苷及龙胆苦苷均为此类物质,因此,该基因亦可能参与了它们的合成,有必要作为本实验中的目标基因进行深入研究。 1.5 SmG10H在体细胞杂种中的表达及其与獐牙菜苦苷含量的关系 半定量RT-PCR分析表明,SmG10H达水平:杂种B24、B132、C47低于亲本川西獐牙菜;B24和B132接近,但高于C47;A6未见表达。表明,不同杂种SmG10H的表达水平存在明显差异。HPLC分析表明,杂种中獐牙菜苦苷含量(0.0074-0.0812 mg/g)低于亲本川西獐牙菜(0.9298 mg/g),其中B24和B132高于C47;A6未检测出獐牙菜苦苷。表明,A6的SmG10H未表达,其不含獐牙菜苦苷;B24、B132表达水平较高,其獐牙菜苦苷含量亦较高;C47的表达水平低,其含量亦低。由此而知,杂种SmG10H表达与獐牙菜苦苷含量呈正相关。总之,含有獐牙菜苦苷体细胞杂种中存在可能来源于供体川西獐牙菜SmG1OH,该基因的表达量与杂种獐牙菜苦苷成正相关。 2.川西獐牙菜环烯醚萜类化合物相关基因的克隆和功能验证 2.1香叶醇10-羟化酶(SmG10H)基因的克隆 采用RACE-PCR技术,从川西獐牙菜中分离了1个香叶醇10-羟化酶基因的全长cDNA,命名为:SmG1OH(CYP76B10,Genbank号为GU168041)。序列分析表明,它们的ORF核苷酸长度为1488 bp,编码496个氨基酸,蛋白质分子量均为55.5 kDa。该基因全长为1637 bp,在882-1030 bp位置有一个大小为149 bp的内含子。系统树分析表明,该基因氨基酸序列在进化上与长春花的CYP76B6具有高的同源性(80.2%)。 2.2 SmG1OH在川西獐牙菜基因组中的分布 Southern blot分析表明,SmG1OH在川西獐牙菜基因组中以单拷贝的形式存在。 2.3环烯醚萜类化合物代谢途径中相关基因的表达分析 2.3.1 SmG1OH在川西獐牙菜中的表达分析 半定量RT-PCR和Real-time PCR分析表明,SmG1OH在川西獐牙菜叶片中高表达,在根和茎中的表达量甚微。SmG1OH在叶中的表达量是根中的24.9倍,茎中的10.2倍。 2.3.2 MeJA对环烯醚萜类化合物合成相关基因表达及药效成分含量的影响 克隆环烯醚萜类化合物合成途径相关的6个基因片段:SmG1OH、DXS、HMGR、IPP-iso和MECS基因,设计特异性引物,分析MeJA处理下,上述基因的表达变化。 1)不同浓度MeJA诱导的SmGl0H表达选用0、10、20、50、100和150μM的MeJA处理川西獐牙菜再生植株,取处理6h的材料进行半定量RT-PCR分析,结果表明,在50μM下SmG1OH表达量高,为适宜的处理浓度。MeJA处理可显著提高SmG10H表达。 2)不同时间MeJA诱导的目标基因表达模式选用50μM的MeJA处理川西獐牙菜,分别取0 h、6 h、12 h、24 h、36 h的再生植株进行半定量RT-PCR和Real-time PCR分析,结果表明,再生植株在MeJA处理6 h,SmG10H、DXS、HMGR.IPP-iso和MECS基因表达开始上调,在24小时时表达量最高,然后呈现下降趋势;在MeJA处理24 h后,IPP-iso. MECS表达最强,然后呈现下降趋势。 3)MeJ处理川西獐牙菜对药效成分含量的影响川西獐牙菜再生植株在50uM MeJA处理不同时间下的HPLC分析表明,随着处理时间的延长,獐牙菜苦苷、龙胆苦苷及芒果苷的含量均持续增加,在24 h-36 h间其增长率最高,而到15 d时含量达到最高,分别为2.62 mg/g,0.67 mg/g和0.21 mg/g,比对照(未处理)分别增加了2.5倍,2.2倍和2.7倍。表明,MeJA能够显著提高川西獐牙菜抗肝炎药效成分含量。 4)MeJA处理下SmG1OH表达与环烯醚萜类化合物含量的关系MeJA处理12 h后,SmG1OH表达水平高,獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量亦增加,表明,SmG10H表达水平与环烯醚萜类化合物含量呈正相关。 2.4 SmG10H基因的功能鉴定 2.4.1 SmG10H在原核细胞大肠杆菌的表达验证 1)表达产物的蛋白特性分析构建了带有SmG10H的大肠杆菌表达载体pET28a-SmG10H,转化到表达型菌株BL21中,阳性克隆经IPTG诱导,提取蛋白进行SDS-PAGE分析,均获得了分子量大小为60 kDa的SmG1OH谱带。对带有His标签的SmG10H进行纯化和等电聚焦实验,发现该蛋白等电点为8.63±0.3。 2)表达产物的LC-MS分析对纯化的SmG10H蛋白在体外加入底物香叶醇后进行液相-质谱法(LC-MS)分析,发现催化反应的目标产物同10-hydroxygeraniol标准品均在8.3 min处存在一个峰,质谱分析证实该峰为10羟基香叶醇。从而表明,SmG1OH在体外具有催化底物香叶醇生成10羟基香叶醇的活性。 3)酶活力测定为了进一步测定酶活力大小,对纯化蛋白体外反应的催化条件进行了优化,确定其最佳催化条件为:pH7.7±0.1,温度为30℃。在此条件下,测得该蛋白的酶活力大小为0.36±0.02(pkat/mg protein)。 2.4.2 SmG10H在真核细胞酵母的功能验证 1)SmG10H在酵母的表达验证构建了酵母表达载体pPICZa-SmG1OH,转入毕赤酵母GS115中,SDS-PAGE分析发现,转基因酵母菌与对照相比均含有SmG10H合成酶谱带,分子量大小为60.0 kDa。分离转SmG10H酵母的膜蛋白,加入底物香叶醇,通过LC-MS分析发现,该膜蛋白的催化产物同10羟基香叶醇标准品的保留时间均为8.3 min,且质谱峰型一致。证明SmG10H能够表达,其产物具有酶活性,可在酵母中直接催化底物香叶醇生成10羟基香叶醇,而未转基因酵母未检测出10羟基香叶醇。 2)SmG10H酶催化特性在体外催化反应中,加入100μgSmG1OH蛋白,反应时间为30 min时,催化反应的目标产物成线性。以此为最佳反应条件,对转基因酵母SmG1OH蛋白进行体外酶催化活性分析,测得该酶的Km=5.2±0.2μM。 2.4.3 SmG10H在植物中的功能验证 1)川西獐牙菜胚性愈伤组织的基因转化利用基因枪法,将过表达载体pBGWF7-SmG10H和RNAi载体pK7GWIWG-SmG10H分别转入培养7 d的川西獐牙菜胚性愈伤组织(分化频率高,达90%以上),暗培养24 h,在高浓度(100mg/L) Kan下筛选出抗性愈伤组织。抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后,用25mg/L Kan进一步筛选再生植株,获得了24株抗性植株(SmG10H的过表达系15株、RNAi系9株)。抗性植株总DNA用35S启动子、ccdB及SmG10H5引物进行PCR检测,鉴定出过表达植株3株、RNAi植株3株。SmG1OH的过表达和RNAi植株转化频率分别为1.6%和2.0%。半定量RT-PCR分析表明,过表达系中SmG10H表达高于对照,而在RNAi系中SmG10H的表达均显著低于对照。 2)转基因植株中10-羟基香叶醇及环烯醚萜类含量分析HPLC测定表明,10-羟基香叶醇、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷齐含量在SmG10H过表达植株(OS1、OS2、OS3)高于对照植株,而在RNAi植株(R1、R2、R3)中低于对照(WT);其变化趋势为:R3R2R1WTOS2OS1OS3。其中,OS3的10-羟基香叶醇、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷齐含量分别为WT的2.65倍,1.71倍和1.91。由此可见,SmG10H的过表达促进了转基因植株环烯醚萜类物质的积累,反之亦然。表明,该基因为环烯醚萜类化合物合成的一个关键酶基因。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S567.239

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李鹏;李新华;张锋;邱登林;;细胞质雄性不育系统中的核质互作研究进展[J];山东农业科学;2008年06期
2 王莉;张艳霞;史玲玲;刘玉军;;功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用[J];北京林业大学学报;2007年05期
3 蔡小东;;利用原生质体融合技术转移作物CMS性状的研究进展[J];长江大学学报(自科版)农学卷;2007年04期
4 付佳,王洋,阎秀峰;萜类化合物的生理生态功能及经济价值[J];东北林业大学学报;2003年06期
5 陈穗云,夏光敏,陈惠民,冯素萍;小麦与高冰草(长穗偃麦草)体细胞杂种株系与其亲本幼苗抗盐性的比较[J];西北植物学报;2000年03期
6 纪兰菊,保怡,陈桂琛,赵明存,孙洪发;15种獐牙菜属植物中主要药用成分的高效液相色谱测定[J];西北植物学报;2004年07期
7 李新岗,马养民,刘拉平,侯慧波,马江平,肖飞;华山松球果挥发性萜类成分研究[J];西北植物学报;2005年10期
8 淮虎银,郭继明,胡芳弟;国产獐牙菜属药用植物资源[J];甘肃科学学报;1995年04期
9 姜燕;;獐牙菜属植物化学成分的研究概况[J];国外医药(植物药分册);1990年03期
10 乔卫;张彦文;吴寿金;;天然环烯醚萜类化合物的生物活性[J];国外医药(植物药分册);2001年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 蔡云飞;植物远缘体细胞杂种的核/质基因组组成及其代谢转录组研究[D];山东大学;2006年
2 刘艳玲;高寒藏药材麻花艽及其体细胞杂种齐墩果酸合成关键酶-β-amyrin合成酶基因克隆及其功能鉴定[D];山东大学;2009年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 夏光敏,陈惠民;小麦体细胞杂交育种研究进展[J];山东农业科学;1999年05期
2 夏光敏,陈穗云,向凤宁,权太勇,陈惠民;小麦与高冰草体细胞杂种F_3~F_5代的耐盐性研究[J];山东农业科学;2001年06期
3 江莉;祁驭矜;向凤宁;夏光敏;;马铃薯体细胞杂交的研究进展[J];山东农业科学;2006年03期
4 张庆华;赵新海;钟丽娟;徐冲;;酯酶同工酶分析鉴别生产用平菇菌种真实性研究[J];山东农业科学;2009年06期
5 钱万英,谢惠安,赵帜平,王保洲,谢万树,邵民;扬子鳄肌肉的POX同工酶的测定研究[J];安徽大学学报(自然科学版);1996年03期
6 陈学平,姜平,张杰瑜,陆星星;种质资源酯酶同工酶的研究[J];安徽大学学报(自然科学版);1998年03期
7 高林,朱立武,丁士林;美味猕猴桃芽变类型POD、EST同工酶研究[J];安徽农学通报;2000年06期
8 李晓蕙;陈蕾;;植物细胞培养技术的发展与应用[J];安徽农学通报;2006年05期
9 孙蓉蓉;肖娅萍;成晓霞;;绞股蓝组培苗添加水杨酸后总黄酮含量及苯丙氨酸解氨酶活性研究[J];安徽农学通报;2008年09期
10 杨丹;程忠泉;刘玉清;赵友兴;周俊;;茯苓皮的化学成分研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2010年19期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙明娜;张勇;马严明;王梅;高同春;;OS-诱抗剂诱导植物抗病性作用的探讨[A];食品安全的理论与实践——安徽食品安全博士科技论坛论文集[C];2005年
2 陈晓丽;刘凤栾;郗琳;杨会芳;阿布都热扎克·依沙克;李俊香;马男;赵梁军;;观赏植物生物技术研究进展[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
3 孙玉强;张献龙;金双侠;梁绍光;朱龙付;聂以春;郭小平;;陆地棉Coker 201和克劳茨基棉对称体细胞杂交的研究[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
4 吴谡琦;刘瑞玉;董金海;王可玲;;中国近海真鲷种群间的基因流及其分化[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
5 王瑛;;离体培养技术在果树种质资源研究中的应用[A];中国科学技术协会第二届青年学术年会园艺学论文集[C];1995年
6 王大勇;朱德蔚;连勇;戴善书;;花粉原生质体研究及其在蔬菜领域的应用潜力[A];中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论会论文集[C];1998年
7 杨青珍;孙海燕;季兰;;榛子过氧化物酶同工酶研究初报[A];第三届全国干果生产与科研进展学术研讨会论文集[C];2003年
8 夏广清;何启伟;赵双宜;王翠花;;转dsRNA-LFY对大白菜开花的诱导效应[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年
9 谷端银;王秀峰;;次生代谢产物研究进展及在蔬菜育种上的应用前景[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
10 姚星伟;孙德岭;刘凡;;植物非对称体细胞融合研究进展[A];中国园艺学会十字花科蔬菜分会第六届学术研讨会暨新品种展示会论文集[C];2008年
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1 宋丽文;两种小蠹虫寄主选择机制研究[D];东北师范大学;2010年
2 周欣;铵离子对中国红豆杉细胞中紫杉烷生物合成的影响及其信号转导机理研究[D];华东理工大学;2011年
3 刘成;多年生簇毛麦基因组新重复序列的分离及其在小麦抗病新种质鉴定中的应用[D];电子科技大学;2010年
4 吕建;小麦渐渗系山融3号MYB基因家族对非生物胁迫的响应及Tamyb31基因功能研究[D];山东大学;2010年
5 张黎明;电磁辐射中低能电子诱导DNA直接损伤的理论研究[D];山东大学;2010年
6 姜峰;拮抗酵母诱导番茄果实抗性基因的分离与功能鉴定[D];浙江大学;2008年
7 牛姗姗;MYB对杨梅果实花青素苷合成的调控及其机制[D];浙江大学;2011年
8 唐丽;湖南南天竹遗传多样性及园林利用评价体系研究[D];中南林业科技大学;2007年
9 马英姿;药用植物蚬壳花椒化学成分分析及繁殖技术研究[D];中南林业科技大学;2010年
10 朱彦涛;甘蓝型油菜Polima CMS和陕2A CMS的形态和生化特征及其胞质遗传物质的比较研究[D];西北农林科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 汪晶;二倍体马铃薯原生质体融合创制抗青枯病的新种质[D];华中农业大学;2009年
2 金占宝;赤拟谷盗不同地理种群差异性比较研究[D];华中农业大学;2010年
3 田伶俐;马铃薯体细胞杂种胞质遗传组成及其与青枯病抗性的关系[D];华中农业大学;2010年
4 陈静;利用杀配子染色体诱导小麦—二倍体长穗偃麦草3E染色体易位研究[D];哈尔滨师范大学;2010年
5 唐磊;两种观赏竹的组织培养研究[D];中南林业科技大学;2009年
6 余雯雯;安徽竹类病害种类调查及主要病害发生规律研究[D];安徽农业大学;2010年
7 侯萌萌;烟草茄尼醇合成途径中dxps基因的克隆与表达[D];郑州大学;2010年
8 胡殿丽;木蝴蝶总黄酮提取工艺和脂肪酸成分研究[D];郑州大学;2010年
9 单洪涛;野生平菇[D];山东农业大学;2009年
10 王庆专;小麦骨干亲本碧蚂4号及其姊妹系遗传差异分析[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李永丽;周洲;李科友;;细胞培养生产药用次生代谢物研究进展[J];安徽农业科学;2006年02期
2 沈宏伟;肖彦春;车仁国;陈金子;金凤燮;鱼红闪;;绞股蓝皂苷最佳提取条件的研究[J];安徽农业科学;2008年04期
3 吴敬德,汪秀峰,吴跃进,郑乐娅;玉米稻的光合效率分析[J];安徽农业科学;1997年02期
4 冷平生,王天华,吴京科,李义,王沙生,毕望富,蒋湘宁;银杏萜类内酯的提取和气相色谱与质谱分析[J];北京林业大学学报;2000年05期
5 王莉;张艳霞;史玲玲;刘玉军;;功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用[J];北京林业大学学报;2007年05期
6 金幼菊,柳维波,吴京科,沈应柏;油松针叶精油萜烯组成的研究(Ⅱ)──萜烯含量与季节、叶龄及朝向的关系[J];北京林业大学学报;1995年04期
7 贾黎明,翟明普,尹伟伦,高立鹏;油松白桦混交林中生化他感作用的生物测定[J];北京林业大学学报;1996年04期
8 杨智,张玉碧,杨占芬,杨存辉;头花龙胆各部位中龙胆苦甙的含量测定[J];白求恩医科大学学报;1985年05期
9 成浩,王玉书,杨素娟,王立;大量元素对茶愈伤组织生长及儿茶素累积的影响[J];茶叶科学;1994年01期
10 白雪芳,张宝琛;植物化学生态学中的克生作用在草业上的表现[J];草业科学;1995年01期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 向凤宁;小麦远缘体细胞杂交及体细胞杂种的遗传研究[D];山东大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 杨艳芳;硅对小麦白粉病的抗性研究[D];南京农业大学;2003年
【相似文献】
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1 王得贤,马莉贞,谢永丽,朱志红,武晓雄,孙海群,杨国柱,李希来,康守鑫,裴海崑,赵永华;几种化学药剂对川西獐牙菜种子萌发的影响[J];植物生理学通讯;2004年02期
2 李冬鸣;曾阳;;藏药川西獐牙菜人工栽培与野生品种有效成分比较研究[J];青海科技;2008年01期
3 拉本;陈志;马永贵;;栽培与野生川西獐牙菜有效成分的研究[J];青海师范大学学报(自然科学版);2010年04期
4 邹小艳;魏立新;杜玉枝;韩青;赵旭东;;正交实验法优选川西獐牙菜的提取工艺[J];安徽农业科学;2008年03期
5 刘建成,陈先玉;川西獐牙菜的组织培养与快速繁殖[J];植物生理学通讯;2003年03期
6 靳有才;肖远灿;邹小艳;吕坪;杜玉枝;魏立新;;HPLC法同时测定2种獐牙菜中4种苷类成分[J];安徽农业科学;2007年07期
7 杨慧玲,刘建全;重要藏药川西獐牙菜种子萌发的研究(英文)[J];云南植物研究;2005年03期
8 苏旭;吴学明;刘玉萍;;川西獐牙菜种子萌发特性的研究[J];中国农学通报;2006年02期
9 才旦;王生畔;李加;王得贤;;藏茵陈类植物育苗初探[J];草业科学;2007年02期
10 吴启勋;宋萍;祁米香;包锦渊;于军;;青海川西獐牙菜HPLC指纹图谱的建立[J];安徽农业科学;2007年20期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 林丽;李硕;高素芳;晋玲;侯嘉;;HPLC法测定藏药线叶龙胆中龙胆苦苷的含量[A];中华中医药学会第十届中药鉴定学术会议暨WHO中药材鉴定方法和技术研讨会论文集[C];2010年
2 吴美香;高洪琳;张霞;欧阳吉德;康乐;;骨筋丸胶囊中秦艽中龙胆苦苷的检测方法研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 宋愿智;姜华;唐永红;;HPLC法测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷的含量[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 葛彦杰;龙杰;崔箫;周欣;王立鹏;;高效液相法测定秦川通痹丸中龙胆苦苷的含量[A];创新沈阳文集(B)[C];2009年
5 吴靳荣;;秦艽不同产区质量评价的研究进展[A];中华中医药学会第九届中药鉴定学术会议论文集——祝贺中华中医药学会中药鉴定分会成立二十周年[C];2008年
6 张超;;HPLC法测定金胆片中龙胆苦苷的含量[A];山东省药学会第一届学术年会论文集(下)[C];2005年
7 李奋勇;齐曼丽;;反相HPLC法测定扁蕾颗粒中龙胆苦苷的含量[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
8 王东;许敏;朱宏涛;张颖君;杨崇仁;;虫草菌丝体对龙胆苦苷的生物转化[A];第五届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2007年
9 冯怡;邓远辉;曾星;杨柳;刘奕明;;液相色谱-串联质谱法测定人血浆中的龙胆苦苷浓度[A];2006年全国药物质量分析学术研讨会——《药物分析杂志》第二届普析通用杯优秀论文评选颁奖会论文集[C];2006年
10 宋愿智;姜华;唐永红;;HPLC法测定耳聋通窍丸中龙胆苦苷的含量[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前9条
1 青科;青海:科技创新促进高原特色生物资源开发[N];中国高新技术产业导报;2009年
2 星子;青海积极构建高原特色生物资源产业链[N];中国特产报;2009年
3 ;细胞工程常用的几种技术[N];云南科技报;2003年
4 本报记者 徐恒杰;大蒜“热”后的冷思考[N];农民日报;2000年
5 丁兆平;借我一双慧眼看中药[N];中国中医药报;2003年
6 黄挺;台湾蝴蝶兰叫响国际花市[N];中国绿色时报;2003年
7 艾秀丽;鹿儿岛回来的基因博士[N];人民日报海外版;2000年
8 徐培丸;国外大蒜生产[N];云南日报;2001年
9 本报通讯员;金川立足科技推动秦艽产业发展[N];阿坝日报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王俊峰;川西獐牙菜体细胞杂交及其环烯醚萜类化合物合成相关基因香叶醇-10羟化酶的克隆和功能验证[D];山东大学;2010年
2 姜少灏;脂肝宁胶囊药代动力学研究暨复方中药药代研究方法初探[D];河北医科大学;2004年
3 王臣;东北龙胆(Gentiana manshurica Kitagawa)栽培生物学研究[D];东北农业大学;2005年
4 金红;三种豆科牧草的原生质体培养及体细胞杂交[D];西北大学;2002年
5 陈雷;龙胆苦苷衍生物合成及药理作用研究[D];西北大学;2008年
6 付春华;原生质体融合创造柑橘新材料及其遗传分析[D];华中农业大学;2004年
7 冯锁民;杜仲化学成分研究及两种新药制剂学研究[D];西北大学;2007年
8 赵晔;桃叶珊瑚苷和龙胆苦苷的热性能与生物代谢研究[D];西北大学;2008年
9 王海波;I 金鸡纳生物碱衍生物的合成方法研究 II 龙胆苦苷衍生物的合成及其对CVB3和SIV的体外抑制作用[D];第四军医大学;2008年
10 马岚;Ⅰ:BK_(Ca)通道参与尼古丁成瘾的实验研究;Ⅱ:龙胆苦苷下调伏隔核GluN2B受体抑制吗啡成瘾的实验研究[D];第四军医大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李冬鸣;川西獐牙菜和椭圆叶花锚醇提物对小鼠降血脂的研究[D];青海师范大学;2011年
2 李子东;高寒藏药材体细胞杂种核/质基因组特征及其成分分析[D];山东大学;2005年
3 刘广华;拟南芥与川西獐牙菜及小麦与鹅观草体细胞杂种的遗传研究[D];山东大学;2006年
4 王伟晶;川西獐牙菜与椭叶花锚醇提物对小鼠急性肝损伤的影响[D];青海师范大学;2011年
5 许丹;高纬北极真菌应用于龙胆苦苷转化的筛选及其转化产物研究[D];华东理工大学;2012年
6 李佳峰;秦艽及近缘种龙胆苦苷积累与环境因子相关性的研究[D];西北大学;2012年
7 黄元元;龙胆苦苷的生物转化与枇杷叶化学成分的研究[D];北京化工大学;2013年
8 付云芳;低能N~+注入介导秦艽基因组DNA转化酵母的研究[D];陕西科技大学;2013年
9 郜尽;龙胆苦苷的制备及药代动力学研究[D];西北大学;2002年
10 李艳秋;龙胆苦苷(Gentiopicroside)的主要药效学研究[D];西北大学;2002年
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