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《山东大学》 2010年
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DNA杂交信号的介质调控和酶法放大研究

周桂萍  
【摘要】:序列决定了DNA分子特性,DNA序列的变化导致人类个体间的差异。约90%的DNA序列变化归因于单核苷酸多态性(SNP),即基因组水平上单个位点碱基的改变。SNP与人类进化、遗传性疾病、个体药物敏感性等困扰人类从而引起普遍关注的问题紧密相关,对SNP的研究将会对人类进化过程、基因定位、药物开发、疾病诊疗等方面产生深远影响。其中,建立适用于遗传性疾病、肿瘤的早期诊断以及诊疗过程的简便快速的SNP检测方法在临床诊疗中具有十分重要的意义。 本论文研究目标就是采用普通的分析仪器,建立简便快速识别具有不匹配碱基的核苷酸链的方法,使之能应用于普通诊疗机构。 一、染料放大DNA杂交信号的研究 插入式荧光染料与DNA双链结合后产生荧光,可以放大DNA的杂交信号,但需要采用荧光光度计检测信号。花青染料在可见光区具有强吸收,如果能与DNA双链特异性结合,就可以将DNA杂交信号转化为可见光区的光吸收信号,用普通分光光度计就可进行检测。本章基于花青染料3-乙基-2-[7-(3-乙基-2-苯并噻唑啉)-1,3,5-庚三烯]碘化苯并噻唑与DNA杂交双链的特异性结合作用,将DNA的杂交信号转化为染料在可见光区的光吸收信号。实验结果表明,与DNA杂交双链结合后,该染料在760 nm处产生强吸收峰,吸光度数值及其稳定性受杂交链长度和体系温度的影响。在25℃条件下,采用24-mer探针,可以检测μg·mL-1数量级的互补DNA链,比DNA自身杂交信号灵敏度提高两个数量级。在优化条件下,利用该染料还可识别短链DNA中存在的SNP。与其它DNA片段的检测以及SNP的识别方法相比,该方法更为简便迅速,在临床诊疗中具有潜在的应用价值。 二、反胶束介质调控DNA杂交反应的研究 DNA杂交反应前后,在260 nm处的吸光度会有变化。杂交双链匹配度不同,吸光度的变化幅度不同。这一光吸收信号可以采用紫外分光光度计检测。但是,水溶液中进行的DNA杂交反应,浓度高至100μmol/L时,DNA分子的紫外吸光度超出仪器检测范围。浓度低至1 u mol/L,杂交前后吸光度的变化幅度小,也观测不到吸光度的变化。 反胶束介质使局部浓集于水核中的DNA分子杂交,同时DNA的表观浓度大大降低,反胶束介质还降低了DNA的杂交反应速度和杂交双链的稳定性,使不同匹配度DNA双链的紫外吸光度产生差异,因此用紫外分光光度计即可检测SNP。但是文献研究表明反胶束中DNA杂交反应速率太慢,单个样品检测周期约4小时。 本章采用合成的24个碱基的DNA片段,在AOT反胶束中研究了影响DNA杂交反应速度的因素。采用析相的方法,使反胶束溶液两相分离,析相后DNA仍存在于有机相(反胶束)中。析相后DNA链仍能进行杂交反应,杂交反应速度加快。根据不同匹配度DNA链杂交后紫外吸光度,可以识别存在不匹配碱基的DNA链。利用库仑滴定法测定有机相中水分含量,双链不匹配度越高,有机相中水分含量越高,根据有机相中水分含量,也可以识别具有不匹配碱基的核苷酸链。 三、DNA杂交信号的酶放大研究 近年来,利用酶催化反应转换和放大各种检测信号的方法越来越受到关注。2002年,Alan S.等人报道了利用生物工程修饰酶放大DNA检测信号的方法,首次将DNA的杂交反应信号转换并放大为酶催化反应信号。但是,该方法的局限性在于对酶、抑制剂和DNA的修饰连接过程太过复杂。 核酸适配体是1990年被发现的一类特殊的寡核苷酸链,可以通过一种称之为SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的离体选择过程获得。1992年通过SELEX筛选出凝血酶核酸适配体,可以抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力。 本章基于凝血酶与G15D核酸适配体的特异性结合原理,在G15D核酸适配体上修饰DNA分子信标结构,修饰后的探针在溶液中形成G-四聚体和分子信标两个结构域,G-四聚体结构域与凝血酶结合,抑制了凝血酶的水解活力。当溶液中存在与分子信标环部互补的DNA链时,由于DNA的杂交反应,使分子信标结构被打开,G-四聚体结构被破坏,凝血酶复活。不同匹配度DNA链与探针链杂交后,探针的G-四聚体结构被破坏的程度不同,凝血酶的活力不同,通过测定凝血酶的活力可以识别具有不匹配碱基的目标链。凝血酶的活力用凝血酶水解纤维蛋白原的初凝时间表示。由于凝血酶凝血时间是临床诊断中一种测定人体凝血功能的常规检测方法,将SNP的识别信号转化为凝血酶凝血时间,将易于在普通的诊疗机构推广应用。 四、核酸适配体对凝血酶的变构作用研究 凝血酶与底物复合物结晶、凝血酶定点突变、分子模拟等方法常常用来研究凝血酶变构作用。通过对凝血酶与凝血酶调制蛋白(thrombomodulin, TM)的结晶复合物检测,发现TM与凝血酶结合并没有引起凝血酶构象改变。但又有研究表明,TM结合于凝血酶使凝血酶对蛋白质C的识别能力增强。对于外结合位点Ⅰ和Ⅱ之间是否有相互作用这一重要问题,也始终没有一致的结论,有的研究认为两个位点之间有构象相关性,即外结合位点Ⅰ与配体的结合会使外结合位点Ⅱ失去与配体的结合能力,但是有些研究又认为两个位点之间没有关联。 G15D核酸适配体特异性结合于凝血酶外结合位点Ⅰ,抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力,抑制凝血酶与TM的结合。DNA 60-18(29)核酸适配体结合于外结合位点Ⅱ,也抑制凝血酶对纤维蛋白原的水解活力。由于G15D核酸适配体和DNA 60-18(29)核酸适配体本身并不被凝血酶水解,并且凝血酶水解发色底物的反应不受核酸适配体的抑制,因此本章用核酸适配体来研究外结合位点对凝血酶的变构作用。 本章我们选用核酸适配体研究外结合位点对凝血酶的变构作用。首先,核酸适配体可以分别结合于凝血酶的两个位点,本身不被凝血酶水解。其次,相对于TM、纤维蛋白原等大分子蛋白类底物,核酸适配体对酶构象和活力检测的干扰大大减小。此外,凝血酶水解小分子发色底物的反应不被核酸适配体抑制,可以直接检测凝血酶水解活力的变化。研究结果表明,核酸适配体与凝血酶的结合会引起凝血酶构象的轻微改变,这种改变可以促进凝血酶对发色底物的水解。这一现象似乎可以说明,大分子底物结合于凝血酶外结合位点,不仅有利于底物的酶切位点与凝血酶活性中心的接触,还可以促进凝血酶的水解活力。 五、基于核酸适配体与凝血酶的相互作用测定凝血酶 本章基于核酸适配体和凝血酶相互作用的研究结果,利用核酸适配体制作生物传感器来检测凝血酶。用方波电势脉冲(SWPP)法制备纳米多孔金电极,将巯基修饰的G15D核酸适配体固定在纳米多孔金电极上,之后利用核酸适配体结合溶液中的凝血酶,凝血酶的另一个结合位点连接与金纳米颗粒结合的巯基-DNA60-18[29]核酸适配体,形成三明治式结构。为了减少凝血酶与金纳米颗粒上核酸适配体的交互作用,还在金纳米颗粒表面固定了不与凝血酶结合的寡核苷酸链。利用电极外层吸附的阳离子还原剂[Ru(NH3)6]3+产生电化学信号。由于纳米多孔金和金纳米颗粒的放大作用,所形成的传感器可以非常灵敏地用于凝血酶的检测。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R346

【参考文献】
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1 苏界殊,龙云飞,周梅芳,李韧韬;灿烂绿与DNA作用的紫外-可见光谱的特性及其分析应用[J];光谱实验室;2004年01期
2 高峰,章丽,卞桂荣,王伦;光谱法研究灿烂甲酚蓝与DNA的相互作用[J];光谱学与光谱分析;2005年11期
3 司文会;訾言勤;屠一锋;;吖啶黄反应光度法测定脱氧核糖核酸含量的研究[J];光谱学与光谱分析;2008年02期
4 文思远;单核苷酸多态性基因分型技术原理与进展[J];生物技术通讯;2003年03期
5 苗延芳;王振永;焦奎;;循环伏安法研究天青A与ds DNA的相互作用[J];分析测试学报;2007年04期
6 夏忠瑜;李原芳;龙云飞;;光谱法研究CTMAB存在下荧光桃红B与fsDNA的相互作用及应用[J];分析测试学报;2007年06期
7 许善峰,李芳,姜涌明,杨生妹;凝血酶的结构及其变构特性[J];中国医学生物技术应用;2004年03期
【共引文献】
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1 谷维娜;施继成;于宏伟;张绍岩;刘会茹;金子林;;水相中钯催化Suzuki偶联反应及其在联苯菊酯合成中的应用[J];安徽农业科学;2009年04期
2 段书德;于宏伟;谷维娜;郧海丽;张东红;任蕾;;农用表面活性剂的研究进展[J];安徽农业科学;2009年07期
3 李铁军;李德全;;农药抗体制备技术研究进展[J];安徽农业科学;2009年27期
4 胡长刚;陈卓;张靓;安娅;刘杰;张笑一;;DSB/油酸钠/油酸/水体系中溶致液晶的研究[J];安徽农业科学;2010年20期
5 夏萍;吴燕;王秉文;衣守志;;自然环境下水分蒸发抑制剂的研究[J];环境科学与管理;2008年12期
6 陈玉梅,左正忠,杨磊,王志军;表面活性剂对电沉积镍/纳米二氧化钛复合层的影响[J];表面技术;2005年05期
7 马涛;;铁酸钴磁性液体的制备及稳定性[J];北京印刷学院学报;2006年06期
8 杨永刚;吕从飞;孟丹;;环保型非离子表面活性剂润版液的配方探讨[J];包装工程;2006年05期
9 王晓芳;魏先福;黄蓓青;陈晓玫;;助剂对水性UV光油性能的影响[J];包装工程;2009年11期
10 刘大勇;赵永和;赵丽娜;王军;;绿色农药乙草胺微乳剂组成的研究[J];江西师范大学学报(自然科学版);2008年01期
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1 李宇;王晓兰;但俊英;颜振宁;;水溶液中Gemini表面活性剂12-5-12与二肽相互作用的电导研究[A];河南省化学会2010年学术年会论文摘要集[C];2010年
2 柳士锋;李林;贺恒;;复配型聚合物在织物洗涤中的应用研究[A];第31届[2011]中国洗涤用品行业年会论文集[C];2011年
3 吴燕;夏萍;衣守志;;脂肪醇乳液抑制水分蒸发的研究[A];第六届中国功能材料及其应用学术会议论文集(9)[C];2007年
4 吴燕;夏萍;衣守志;;长短链醇混合单分子膜抑制水分蒸发的研究[A];第六届中国功能材料及其应用学术会议论文集(9)[C];2007年
5 杜玉成;史树丽;何洪;;纳米棒状结构Ce_(0.7)Zr_(0.3)O_2制备及机理研究[A];2009中国功能材料科技与产业高层论坛论文集[C];2009年
6 晋来超;施云海;李海涛;刘洪来;;含羟丙基Gemini阳离子表面活性剂与SDS的复配性质研究[A];上海市化学化工学会2010年度学术年会论文集[C];2010年
7 郑永勇;李斌栋;吕春绪;;N-十六烷基硼酸二乙醇胺酯的合成及其表面活性研究[A];第二届全国精细化工药物(医药、农药、兽药)中间体学术交流会论文专辑[C];2005年
8 鹿桂乾;张利萍;;常用表面活性剂的去污性能对比[A];第28届[2008]中国洗涤用品行业年会论文集[C];2008年
9 陈玲;许虎君;陈雪;李丹;;支链脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的合成和性能[A];“闰土”杯第四届中国纺织印染助剂行业学术年会论文集[C];2010年
10 宋利;林翠英;姜蓉;赵剑曦;;分子内电荷扭转探针DMABN测定表面活性剂水溶液的临界胶束浓度[A];中国化学会第十一届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2007年
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2 李翌;表面活性素在溶液中胶束化行为的研究[D];华东理工大学;2011年
3 汤丹;新型生物传感器的研究及其在核酸和蛋白质检测方面的应用[D];吉林大学;2011年
4 孔玲;蛋白质、多肽与DNA相互作用的共振瑞利散射和共振非线性散射光谱及其分析应用研究[D];西南大学;2011年
5 延辉;两亲分子自组装体系及其耐盐机理的理论研究[D];山东大学;2011年
6 赵玉荣;非典型性双亲分子参与构建有序分子聚集体的理论模拟与实验研究[D];山东大学;2011年
7 聂宏骞;LDHs诱导囊泡形成及(药物-LDHs)@囊泡复合体研究[D];山东大学;2011年
8 李国宝;电化学方法研究阳离子C_nTAB及其复配体系的聚集行为和性质[D];山东大学;2011年
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1 胡琳珊;循环伏安法对CTAB/SDS混合体系有序组合体性质的研究[D];山东科技大学;2010年
2 李伟伟;水溶液中二肽—表面活性剂相互作用的电导和荧光光谱研究[D];郑州大学;2010年
3 郝娟;硅油乳化相关因素体外研究[D];郑州大学;2010年
4 陈慧博;多分枝非离子表面活性剂的合成、改性及在破乳方面的应用[D];郑州大学;2010年
5 王刚;固体泡沫添加无机物后特性参数的实验研究[D];辽宁工程技术大学;2009年
6 程娟;食品微乳液制备及其在面制品中的应用[D];河南工业大学;2010年
7 武秋花;聚乙烯亚胺与表面活性剂相互作用的性质研究[D];河南师范大学;2010年
8 黄莉云;润滑油硫化烷基酚钙清净分散剂组成研究[D];华东理工大学;2011年
9 康雪丽;Gemini/DNA复合膜在气/液界面上的性质研究[D];华东理工大学;2011年
10 梁嘉铭;采用添加剂表面改性和洗涤废水提高低阶煤成浆性的研究[D];浙江大学;2010年
【二级参考文献】
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1 宋功武,成耀鹏,何治柯,曾云鹗;小蘖碱与核酸作用荧光光谱及其分析应用[J];分析化学;1999年01期
2 黄新华,舒为群,李原芳,黄承志;溴代十六烷基三甲基铵敏化亮绿脱氧核糖核酸作用的共振光散射增强研究[J];分析化学;2001年03期
3 杨传孝,李原芳,奉萍,黄承志;铝离子与脱氧核糖核酸作用的共振光散射研究[J];分析化学;2002年04期
4 凌连生,杨洗,何治柯,曾云鹗;Ru(bipy)_2(dppz)~(2+)与DNA相互作用的光谱研究[J];分析科学学报;2001年01期
5 陈秋影,杨黄浩,李东辉,郑洪,朱庆枝,许金钩;耐尔蓝荧光探针法测定核酸[J];福州大学学报(自然科学版);1999年S1期
6 李天剑,沈含熙;乙基紫-脱氧核糖核酸共振发光体系的研究及其分析应用[J];高等学校化学学报;1998年10期
7 方光荣,宋功武,李玲,詹红菊,李襄宏;流动注射荧光分光光度法测定DNA的研究[J];光谱学与光谱分析;2002年04期
8 方光荣,李玲,蔡朝霞,刘立明,宋功武;镧与邻菲咯啉和联吡啶的混配物的合成及其与DNA作用的研究[J];光谱学与光谱分析;2004年03期
9 李韧韬,龙云飞,程曦,苏界殊;十六烷基三甲基溴化铵增敏砂罗铬花青R共振光散射法检测DNA[J];化学分析计量;2004年01期
10 李红,乐学义,吴建中,刘捷,计亮年,a蒋雄,李伟善,徐政和;铜(Ⅱ)邻菲咯啉蛋氨酸配合物与DNA相互作用的研究[J];化学学报;2003年02期
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1 张丽容,刘迺丰,陈日新,张丽珊,黄鹰,李方园,王世浚;心肌病患者线粒体DNA异常的探讨[J];中国优生与遗传杂志;1993年04期
2 陈至善!200052上海,熊显华!200052上海;肾癌细胞增殖活性与预后的关系[J];临床肿瘤学杂志;1998年02期
3 张秀荣,孟如松,李春启,毛高平,王建荣;大肠癌及各类型大肠息肉流式细胞DNA定量研究[J];空军总医院学报;1998年03期
4 原银栋,刘庆阳,原泉,赵耀;恶性骨肿瘤中血管内皮生长因子表达的定量研究[J];中华骨科杂志;1999年07期
5 陈建庭,李菊根,金大地;血小板衍生生长因子促进成骨细胞DNA合成的实验研究[J];中华外科杂志;1999年07期
6 张淑娟,宋炜辉;治疗淋菌性结膜炎的用药观察[J];黑龙江医药科学;1999年03期
7 李秀珍;微波对脑的影响[J];国外医学.卫生学分册;2000年05期
8 邱方城,熊琛,严礼华,张志华,郑卫东;PCR检测HBVDNA的初步研究[J];郧阳医学院学报;2000年01期
9 李昕权,李丰益,廖清奎,罗春华;白血病随机扩增多态DNA分析及其临床意义[J];中国小儿血液;2000年06期
10 武大林;HLA方法学进展及其DNA分型应用[J];第一军医大学学报;2001年06期
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1 刘海英;陈刚;步宇翔;;碱基对的多铜修饰对DNA导电性的增强作用[A];中国化学会第28届学术年会第13分会场摘要集[C];2012年
2 赵宏远;李俊杰;桑润滋;;单细胞凝胶电泳技术检测不同处理山羊精子DNA损伤[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(下册)[C];2010年
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4 梁春柳;;一个新的筛选化合物与DNA交互作用的简便方法[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
5 张文众;李永宁;方瑾;梁春来;张倩男;;体外新评价方法——完整细胞核DNA检测板[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年
6 邹丹丹;汪海林;;基于DNA甲基化结合蛋白MBD的甲基化分析[A];中国化学会第28届学术年会第2分会场摘要集[C];2012年
7 张晔;杜智;杨斌;高英堂;;检测外周血中游离DNA的应用前景(综述)[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年
8 赵淑珍;刘光珍;;DNA免疫吸附治疗狼疮性肾炎的临床观察[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
9 陈士林;;中药DNA条形码鉴定体系[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
10 陆佳飞;周克隆;王缦;;磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究及其在诊断试剂中的应用[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
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1 陈杰;信息技术将重组汽车DNA[N];科技日报;2010年
2 刘霞;科学家研发出新型人工合成DNA载体[N];科技日报;2010年
3 南方;化危为机 企业需韧性生长的DNA[N];中国企业报;2009年
4 吴强;港大引新技术DNA辨食材[N];中国食品质量报;2010年
5 本报记者 施晓焰 通讯员 马丽娟;云南:DNA数据库成“打拐”得力帮手[N];人民公安报;2009年
6 张巍巍;垃圾DNA可促进癌症发展首获证实[N];科技日报;2010年
7 常丽君;虱子DNA表明人类17万年前首次穿衣[N];科技日报;2011年
8 记者 冯卫东;DNA碱基序列决定其光敏性假设获证实[N];科技日报;2008年
9 许文强;拆、装更便捷的DNA双螺栓结构模型[N];大众科技报;2008年
10 记者 常丽君;研究人员发现自组装DNA链的最佳长度[N];科技日报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭晓兰;端粒功能异常诱导的DNA损伤反应及其在肿瘤发生中的作用与分子机制[D];重庆医科大学;2010年
2 陈志健;1.8 GHz微波对X射线和阿霉素致淋巴细胞DNA损伤修复及对蛋白表达的影响[D];浙江大学;2010年
3 朱慧芳;Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究[D];浙江大学;2009年
4 万超;抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究[D];武汉大学;2009年
5 赵丽霞;克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
6 沈美龙;基于DNA免疫的乙型肝炎病毒表面抗原大中小蛋白的免疫原性研究[D];南京医科大学;2010年
7 徐铁刚;细菌DNA磷硫酰化修饰与限制[D];上海交通大学;2008年
8 高鹏;特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D];吉林大学;2011年
9 康大伟;DNA分子器件场效应理论研究[D];山东大学;2010年
10 高天;基于寡核苷酸芯片的地中海贫血特异性DNA甲基化的研究[D];第三军医大学;2009年
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1 李芳;基于磁性微粒的法医样本DNA纯化[D];西北大学;2011年
2 芦丽淦;柚皮素及聚乙二醇增强乙肝DNA疫苗免疫效果的研究[D];河南大学;2010年
3 杨锦艳;六种香豆素有效成分与DNA相互作用的研究[D];山西医科大学;2010年
4 林启凰;用于乳腺蛋白标志基因检测的DNA电化学生物传感器的研究[D];福建医科大学;2010年
5 于文静;亚麻韧皮部特异启动子克隆与26份种质DNA指纹图谱构建[D];中国农业科学院;2010年
6 Rebecca Simisola Agboola;硼(B)和氯化钠胁迫处理诱导高粱(Sorghum bicolor)自交系发生形态和DNA甲基化的变异[D];东北师范大学;2010年
7 石微;溴氰菊酯致大鼠DNA损伤及损伤后修复功能的影响[D];青岛大学;2010年
8 张诺;DNA-纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用[D];济南大学;2010年
9 郭珈辰;基于图形表示的DNA相似性分析及进化树构建算法研究[D];湖南大学;2010年
10 刘香港;基于功能材料的新型电化学DNA生物传感器的研制及应用研究[D];山东农业大学;2011年
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