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《山东大学》 2011年
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重组人促红细胞生成素对大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤神经保护作用的实验研究

宁斌  
【摘要】:第一部分大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤实验模型的建立 目的 构建大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤的动物模型,并通过行为学评分、组织学染色等方法对该模型进行评价。 方法 清洁级雌性Wistar大鼠60只,随机分为两组:假手术组(A组,n=30),每个时间点6只,只行椎板切除术不作颈脊髓压迫操作;脊髓亚急性压迫组(B组,n=30),每个时间点6只,制作颈脊髓亚急性压迫性损伤的模型。分别在术后3d, 7d,14d,21d,28d时间点,用BBB评分评价四肢运动功能;在两组中随机选取2只大鼠,行脊柱侧位X线检查,观察压迫装置与脊柱间的相对位置关系,压迫装置是否松动、移位或脱落,并了解颈脊髓受压迫的程度。将颈脊髓做病理切片,行HE染色,观察颈髓损伤病变的情况。 结果 实验结果显示,部分大鼠于术后24h内出现瘫痪,考虑为急性损伤所致,少数大鼠死亡,舍弃上述两类,并重新造模补齐。亚急性损伤的大鼠则在7d后逐渐出现瘫痪,其身体僵硬程度轻或软瘫,前爪轻度掌曲,尚能爬动和进食,膀胱充盈但未失禁或癃闭。大部分模型仅见动作迟缓,未出现畸形和异常体位。肢体运动功能的评估结果示:在3、7d时间点,两组间BBB评分相比较差异无统计学意义(p0.05);14d,A组和B组评分相比,差异有统计学意义(p0.05);21、28d,A组和B组分别评分相比,差异有统计学意义(p0.01)。大鼠脊柱侧位X线示:颈脊髓压迫装置在其颈椎内固定位置较好,压迫螺钉正好与脊髓外膜相接触,进而造成颈脊髓压迫;行大鼠颈椎过伸过屈侧位片,未见脊髓压迫装置松动及脱落。HE染色结果可见:低倍镜下观察,A组大鼠的颈脊髓表面未见挤压痕迹,B组大鼠的颈脊髓表面都有不同程度的压痕,并且受压处的脊髓组织随时间推移逐渐出现液化坏死,瘢痕化。高倍镜下观察,A组大鼠的颈脊髓神经元细胞形态正常,胞膜、核膜染色清晰,胞核位于细胞中央,大而圆,核染色质较少,弱嗜碱性染色呈淡蓝色,核中央核仁显色清楚,胞浆呈弱酸性染色呈淡红色,伴有较多突起。B组大鼠的颈脊髓可见神经元细胞肿胀明显、甚至出现空泡,胞核浓缩深染、核溶解,核固缩,结构消失,血管周围间隙增宽,神经轴索周围间隙增宽,白质呈疏网状改变;随颈髓受压时间延长,术后14、21、28d,镜下可见胞质浓缩、核固缩深染等明显改变,并伴有神经元细胞数目的减少及神经胶质细胞的增生。 结论 本实验成功构建大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤的动物模型,并对模型进行系统的行为学评分及相关的病理学检查,证实是本实验的模型为一个较理想模拟亚急性压迫性颈脊髓损伤的动物试验模型。 第二部分促红细胞生成素及其受体在大鼠颈脊髓组织中的表达 目的 本实验旨在阐述颈脊髓亚急性压迫性损伤后EPO及EPO-R的表达及时间分布规律,及rhEPO对动物模型的治疗作用。 方法 清洁级雌性Wistar大鼠80只,随机分为四组:假手术对照组(A组,n=5),只行椎板切除术不作颈脊髓压迫操作;生理盐水对照组(B组,n=25):建模术后7d静脉推注给予生理盐水1mL/d安慰治疗;小剂量rhEPO治疗组(C组,n=25):建模术后7d静脉推注给予500units/kg b. w. rhEPO治疗;大剂量rhEPO治疗组(D组,n=25):建模术后7d静脉推注给予5000units/kg b. w. rhEPO治疗。在建模手术后,分别于第3、7、14、21、28d,采用Basso运动功能评分法,进行肢体运动功能的评分。BBB评分为22分制,观察下肢没有肌肉收缩或运动为0分,正常运动为21分;在动物完全清醒状态下,通过观察下肢活动和承重能力,对其肢体肌力进行评估。并于相应时间点,处死动物,取出损伤节段颈脊髓,做石蜡切片并进行EPO及EPO-R的免疫组化染色。 结果 肢体运动功能的评分结果,在3、7d时间点,各组间BBB评分相比,差异无统计学意义(p0.05); 14d, C组和D组分别与B组评分相比差异有统计学意义(p0.05),21.28d,C组和D组分别与B组评分相比差异有显著统计学意义(p0.01);在各检测时间点,C组和D组评分无统计学差异(p0.05)。A组:正常大鼠颈脊髓内EPO阳性细胞的均数为10.6±2.5,EPO-R阳性细胞均数为8.6±1.2,均数在随后的时间点无明显改变。B组:损伤后3d,EPO阳性细胞的均数为10.2±2.9,EPO-R阳性细胞均数为9.5±1.7,与对照组相比,二者间统计学上无显著性差异(p0.05);手术后7d,EPO阳性细胞的均数为10.7±2.3,EPO-R阳性细胞均数为10.8±2.2,与对照组相比,二者统计学上无显著性差异(p0.05);手术后14d,EPO阳性细胞的均数明显减少,计数为8.2±2.1,与对照组相比,二者间统计学上仍无显著性差异(p0.05),另一方面EPO-R阳性细胞的均数反应性增多,计数达到26.31±6.3,与对照组相比,二者间统计学上存在显著性差异(p0.05),且均数值很高;手术后28d,EPO阳性细胞的均数为13.8±2.4,EPO-R阳性细胞均数为12.6±4.1,与对照组相比,二者间统计学上无显著性差异(p0.05)。 结论 EPO及EPO-R是一种内源性的神经保护系统,可能在神经损伤修复过程中具有重要的作用,脊髓损伤后EPO-R反应性增多,为外源性EPO提供靶点。颈脊髓亚急性压迫性损伤后给予rhEPO可取的良好的临床治疗效果。 第三部分rhEPO对大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤后神经细胞凋亡的作用 目的 本实验研究不同剂量的重组人促红细胞生成素(rhEPO)对大鼠颈脊髓亚急性压迫性损伤后神经细胞凋亡的作用。 方法 清洁级雌性Wistar大鼠80只,假手术对照组(A组,n=5),只行椎板切除术不作颈脊髓压迫操作;生理盐水对照组(B组,n=25):建模术后7d静脉推注给予生理盐水1mL/d安慰治疗;小剂量rhEPO治疗组(C组,n=25):建模术后7d静脉推注给予500units/kg b.w.rhEPO治疗;大剂量rhEPO治疗组(D组,n=25):建模术后7d静脉推注给予5000units/kg b. w. rhEPO治疗。手术后分别于3、7、14、21、28d各时间点处死模型,取损伤的颈脊髓标本进行原位末端标记法(TUNEL)染色和流式细胞仪定量检测细胞凋亡情况。 结果 TUNEL标记阳性的细胞核被染成棕褐色,胞浆复染为淡蓝色。B组,7d, TUNEL染色阳性的细胞很少见;14d,在压迫部位灰质中观察到阳性细胞,包括颈髓前后角神经元;21d,压迫节段的脊髓灰质发现大量的TUNEL阳性运动神经元细胞,并且伴有一些形态不确定的阳性小细胞;28d时仍有大量的阳性细胞,同21d相比数量没有明显差异。在C、D组,7、14d,脊髓仅发现很少的TUNEL阳性细胞;21d,运动神经元阳性细胞数量较B组明显减少,且在28d在脊髓白质中甚至在脊髓后柱仅有很少TUNEL阳性的细胞。B组凋亡细胞数量从14d开始明显增加,在21d凋亡细胞数量达到峰值,并维持至28d仍有较多凋亡细胞数量。同C、D组相比,7d时,各组细胞数量没有明显差异;21d时,C组和D组神经细胞数量同B组相比差异有统计学意义(p0.01)。 结论 rhEPO通过抑制亚急性压迫性颈脊髓损伤后神经细胞的凋亡而起到神经保护作用,这为rhEPO用于亚急性颈脊髓压迫性损伤的治疗提供了理论依据,为临床治疗亚急性颈脊髓损伤提供了新的措施和思路。 第四部分rhEPO对大鼠颈脊髓亚V急性压迫性损伤后炎性因子表达的作用 目的 本试验研究不同剂量的重组人促红细胞生成素(rhEPO)对亚急性颈脊髓压迫性损伤细胞因子表达的调节作用,旨在探讨其对颈髓继发性损伤作用的机制。 方法 清洁级雌性Wistar大鼠80只,假手术对照组(A组,n=5),只行椎板切除术不作颈脊髓压迫操作;生理盐水对照组(B组,n=25):建模术后7d静脉推注给予生理盐水1mL/d安慰治疗;小剂量rhEPO治疗组(C组,n=25):建模术后7d静脉推注给予500units/kg b.w. rhEPO治疗;大剂量rhEPO治疗组(D组,n=25):建模术后7d静脉推注给予5000units/kg b.w. rhEPO治疗。手术后分别于3、7、14、21、28d各个时间点处死模型,取损伤的颈脊髓标本,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测IL-8, TNF-a, IL-6和IL-1β的含量。 结果 ELISA结果:IL-8检测示,术后3d, B、C、D组表达到达峰值,B组术后28d持续高表达;C,D组在术后21d表达显著降低(p0.05),尤其以D组降低为著(p0.01);术后28d,C,D组表达显著降低,同B组相比均具有显著统计学意义(p0.05)。TNF-α结果示,术后第7d, B、C、D组表达到达峰值,B组术后28d表达持续降低,C,D组在术后14d表达显著降低(p0.05),术后28d,C,D组表达较21d时无显著变化,同对照组相比均具有显著意义(p0.05)IL-6检测示,术后第7d, B、C、D组表达到达峰值,随后各组表达显著降低,D组在术后21d表达较对照组显著降低(p0.05),但是C组降低不明显。术后28d,C,D组表达无明显变化。IL-1β结果示,术后第3d, B、C、D组表达到达峰值,B组术后14d开始表达降低,C,D组在术后第7d开始表达显著降低(p0.05)。术后21、28d, B、C、D组表达量无明显差异。 结论 颈脊髓亚急性压迫性损伤后给予rhEPO能抑制多种细胞因子及趋化因子生成及表达,减轻损伤后炎症反应,EPO在炎症反应及免疫调节等方面有重要作用。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R651.2

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