多壁碳纳米管的表面化学修饰调节其免疫毒性的机理研究

【摘要】：碳纳米管(CNTs)是一种具有独特结构和物理化学性质的新型纳米材料,其独特的性质吸引了众多学者的研究兴趣,其中以生物医学应用为目标的探索性研究正在迅速发展成为一个新的研究领域。 多壁碳纳米管(MWCNTs)是碳纳米管的一种,其应用于医学领域必须具备很多特性,包括生物相容性、无毒、不致癌、不致畸、不致突变等。通过引入功能化基团,碳纳米管的水溶性和生物相容性得到改善,从而为其在生物医学领域的应用奠定了基础。近几年来,对碳纳米管在分子水平和细胞水平上应用的研究逐渐引起人们的关注,纳米医学也应运而生,随之而来的毒性评价和机理研究日益引起学者们的重视,免疫毒性即是其中的一个重要方面。巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞,在免疫反应的多个阶段发挥重要作用,其主要功能是清除异物、抗原递呈、调节免疫反应和炎症反应。功能化多壁碳纳米管(f-MWCNTs)进入机体后,对巨噬细胞产生毒性并影响其生物学功能的机制研究尚不透彻,关于调控其免疫毒性的方法更是没有涉及。我们率先开展该领域的研究,并取得了一些初步的成果。 本研究以含有80种材料的f-MWCNTs库为基础,以PMA诱导的THP-1类巨噬细胞为模型,通过检测细胞活力和炎症因子,评价f-MWCNTs对巨噬细胞的细胞毒性和功能影响。结果表明,MWCNTs经不同的功能化修饰后,对巨噬细胞的毒性显著不同。从中选出毒性较小的一种MWCNT2,以目前常见的且毒性较大的羧基化碳纳米管MWCNT 1为参照,研究它们对巨噬细胞的作用机制。 多壁碳纳米管经功能化修饰后,显著降低其对巨噬细胞的毒性,表现在：相对于MWCNT 1, MWCNT 2刺激后的巨噬细胞活力明显升高,而引发的炎症相关因子(TNF-α和NO)和活性氧(ROS)降低,且不影响细胞功能。本研究中的两种多壁碳纳米管均能够被巨噬细胞摄入,且摄入量和细胞内定位均相似,所不同的是它们的倾向被不同的受体识别。MWCNT 2选择性的优势识别巨噬细胞表面的清道夫受体(Macrophage scavenger receptor, MSR)而很少被甘露糖受体(Mannose receptor, MR)所识别,而MWCNT 1对这两种受体没有显著不同的选择性差异。巨噬细胞的MR识别其配体后,引起细胞内ROS生成并激活NFκB信号通路,从而促使炎症因子生成,引发一系列炎症反应。然而,MWCNT 2选择性识别MSR,这是一种不激活NFκB信号通路、不引起炎症反应的摄入方式。 以往的研究已经证实碳纳米管能够引起哺乳动物细胞和小鼠体内的氧化损伤、NFκB信号通路活化以及前炎症因子释放。本研究的重要意义在于发现了MWCNTs作用于巨噬细胞引发NFκB信号通路活化的一种上游机制,即甘露糖受体识别MWCNTs并将其摄入,进而引发NFκB信号通路活化和一系列炎症反应。而更重要的是,我们基于该机制提出了通过表面化学修饰,改变MWCNTs与表面受体的识别模式,使其倾向于被清道夫受体所识别,进而引发不引起炎症反应的信号通路。这表明,碳纳米管的表而化学修饰可以通过被清道夫受体优势识别,进而减弱NFκB信号通路的活化程度,最终达到调控其巨噬细胞的免疫毒性的目的。 本研究进一步以BALB/c小鼠为模型评价多壁碳纳米管的功能化修饰对小鼠引起的炎症效应。通过尾静脉注射MWCNTs入小鼠体内,发现其体内分布主要集中在富含单核/巨噬细胞的肝脏、肺脏和脾脏。因此,MWCNT 1和MWCNT 2经尾静脉注射入小鼠体内后,检测其已发上述三个脏器的炎症因子,发现MWCNT 2在肝脏和肺脏中引起的炎症因子显著少于MWCNT 1,说明碳纳米管功能化修饰降低其引发的炎症因子在小鼠体内同样有效。通过肝脏、肺脏和脾脏三个器官NFκB信号通路活化情况的检测,我们进一步发现,MWCNT 2在一定程度上降低了NFκB信号通路的活化程度,从而降低其小鼠体内的炎症反应。由于条件所限,我们没有获得清道夫受体基因缺陷的小鼠作为实验模型,深入探讨MWCNT 2减弱NFκB信号通路活化的原因,是否与我们在体外研究中获得的结论一致,即倾向被清道夫受体识别引起NFκB信号通路活化减弱、炎症反应减轻。但是,MWCNTs的功能化修饰的确通过减弱其NFκB信号通路活化程度而降低其免疫毒性。 综上所述,碳纳米管可以通过特殊的功能化修饰降低其引发的炎症效应,该调控过程可通过倾向巨噬细胞清道夫受体识别及减少NFκB信号通路活化实现。基于促使多壁碳纳米管识别模式由甘露糖受体向清道夫受体识别转化、进而减弱NFκB信号通路的活化程度、最终实现免疫毒性调控的机理,用表面化学修饰实现该调控,以此获得不同免疫效应的纳米材料,有利于满足其更多领域的应用要求。本研究为碳纳米管的广泛生物医学应用提供材料改性方法的理论依据,使得纳米材料有望用于新型治疗药物的研发,并为药物载体的设计研发提出新的思路。