斜卧青霉胞外蛋白质组学分析与纤维素酶合成调控机制研究

【摘要】：木质纤维素是地球上产量巨大而又未得到充分利用的可再生资源。在石油资源日趋枯竭和环境恶化的严峻形势下,发展生物质能源,利用木质纤维素生产液体燃料和化工产品,不仅可以减缓石油消耗,缓解能源资源紧缺,同时还可以保护环境,促进全球经济的可持续发展。利用微生物产生的纤维素酶分解和转化木质纤维素是纤维素利用的有效途径。丝状真菌所产生的纤维素酶多是胞外酶,便于分离和提取,且所产生的纤维素酶各组分较为齐全,适宜用于工业化生产。但纤维素酶的效率低、成本高是大规模工业化应用中的主要瓶颈。对丝状真菌纤维素酶酶系组成及其合成调控机制的研究对于提高酶的产量和活性都具有重要的意义。 目前国内外对丝状真菌纤维素酶的研究主要围绕木霉和曲霉展开,应用基因组学、转录组学、蛋白组学等技术在酶系组成、合成调控等方面取得了一定进展,而对其它丝状真菌纤维素酶系组成和合成调控研究较少,尤其是青霉属真菌。本论文以我们实验室筛选的斜卧青霉为研究对象,对其胞外酶系组成进行了研究,比较了野生菌株和高产突变菌株在不同培养条件下纤维素降解酶系基因转录情况和胞外蛋白产生情况,并对两个可能与突变菌株高产性状相关的基因进行了初步功能分析。这些研究有助于深入认识斜卧青霉的胞外酶系组成和纤维素酶表达调控机制,对进一步开展菌株改造具有一定借鉴意义。 本论文的主要研究结果如下： 1.克隆了斜卧青霉内切葡聚糖酶基因celSA与cel7B,并在酿酒酵母中进行了异源表达,研究了重组酶的酶学性质 采用简并PCR和]TAIL-PCR技术克隆了斜卧青霉的两个内切葡聚糖酶基因cel5A和cel7B。cel5A基因全长为1549 bp,含有3个内含子。cel5A cDNA包含个长度为1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸。cel7B基因全长为1425 bp,不含有内含子,编码474个氨基酸。Southern杂交结果表明,cel5A和cel7B基因在染色体上均以单拷贝形式存在。荧光实时定量PCR转录分析表明,cel5A和cel7B基因转录是共调控的,均受葡萄糖的抑制和纤维素的诱导。构建了cel5A和cel7B基因在酿酒酵母中表达的重组质粒,并成功表达和纯化了两个重组酶。重组Cel5A和Cel7B最适作用均为60℃,最适作用pH均为4。重组Cel7B降解CMC、大麦p-葡聚糖和磷酸膨胀纤维素的活性分别是Cel5A的8倍、30倍和5倍,但是降解微晶纤维素的能力两个酶相差不大,且Cel5A降解微晶纤维素的产物主要为纤维二糖和痕量葡萄糖。这些结果说明相对Cel5A, Cel7B是更为严格的内切葡聚糖酶。 2.分析了不同碳源对斜卧青霉野生菌株和突变菌株纤维素酶和半纤维素酶基因转录的影响 采用RT-qPCR技术对斜卧青霉114-2和JU-A10-S在不同碳源培养条件下的4个纤维素酶基因(cel7B、cel5A、cel7A、cel6A)和2个木聚糖酶基因(xynl0A、xyn11A)的转录情况进行了分析,发现这些基因在转录水平上是共调控的。微晶纤维素或者微晶纤维素与麦麸对菌株114-2和JU-A10-S中纤维素酶和半纤维素酶基因的表达都有很强的诱导作用,且.微晶纤维素与麦麸的诱导效果要强于微晶纤维素的诱导效果。乳糖对菌株114-2中纤维素酶和半纤维素酶基因表达有很强的诱导作用,但是对菌株JU-A10-S没有表现出明显的诱导作用,可能与乳糖的转运或者代谢途径受到了破坏有关。山梨糖对菌株JU-A10-S中纤维素酶和半纤维素酶基因表达有很强的诱导作用,但是对菌株114-2没有表现出明显的诱导作用,可能与山梨糖的代谢速率无关,而是由其它突变引起的。菌株JU-A10-S在葡萄糖培养条件下,纤维素酶和半纤维素酶基因转录水平要远远高于菌株114-2中各基因转录水平,表现出显著的抗降解物阻遏。菌株JU-A10-S在所有培养条件下,纤维素酶和半纤维素酶基因转录水平都要高于菌株114-2中各基因转录水平,可能与creA的移码突变部分有关。 3.利用双向荧光差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)研究了斜卧青霉胞外酶系组成,并对野生菌株与突变高产菌株在不同培养条件下的胞外差异蛋白进行了分析 利用双向荧光差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)对斜卧青霉野生菌株114-2与突变高产菌株JU-A10-T在葡萄糖、微晶纤维素-麦麸培养条件下的胞外蛋白进行了分析。成功鉴定出了38种蛋白,其中大部分蛋白为生物质降解酶类,参与纤维素、半纤维素、淀粉、蛋白质、果胶、几丁质等的降解。野生菌株114-2在葡萄糖培养条件下,鉴定到3种基础性表达纤维素酶,并鉴定到含量较高的淀粉酶、果胶酶和蛋白酶PepA。野生菌株114-2在微晶纤维素-麦麸培养条件下,胞外纤维素酶和半纤维酶的种类和含量都在增加,但并未检测到果胶酶,显示果胶酶与(半)纤维素酶的合成分别属于不同的调控体系。此外,在胞外还检测到了含量较高的蛋白酶PepB,而并没有检测到蛋白酶PepA,显示这两种蛋白酶的合成受培养条件的影响。突变菌株JU-A10-T在葡萄糖培养条件下,表现出明显的抗降解物阻遏特性,胞外纤维素酶和半纤维素酶含量明显上调,并出现更多种类的纤维素酶和半纤维素酶,但淀粉酶的合成受到了抑制。突变菌株JU-A10-T在微晶纤维素-麦麸培养条件下,表现出明显的超诱导,胞外蛋白浓度、纤维素酶活和木聚糖酶活大幅度提高；胞外蛋白中几种纤维素酶和半纤维素酶组分含量明显上调,而其它纤维素酶和半纤维素酶的含量则几乎都下调,显示木质纤维素降解酶受到的调控之间存在部分差异；另外只检测到痕量淀粉酶并且未检测到蛋白酶,显示突变株中相关调控系统发生了重要变异。 4.敲除了斜卧青霉α-甘露糖苷酶基因和丝氨酸蛋白激酶基因,对其生物学功能进行了初步研究。 利用融合PCR和巢式PCR方法构建了α-1,2-甘露糖苷酶基因(mns1)和丝氨酸蛋白激酶基因(pk1)敲除盒,并利用原生质体转化的方法,成功敲除了斜卧青霉KU-39 mns1基因和pk1基因。α-1,2-甘露糖苷酶基因(mns1)和丝氨酸蛋白激酶基因(pk1)的敲除对菌株的菌落大小、孢子颜色、孢子形态、菌丝直径均没有影响。α-1,2-甘露糖苷酶基因(mns1)的敲除,提高了胞外蛋白浓度和纤维素酶活力,猜测其可能参与了未正确折叠蛋白的清除。丝氨酸蛋白激酶基因(pk1)的敲除,也提高了胞外蛋白浓度和纤维素酶活力,其参与的信号传导过程有待进一步研究。

【关键词】：斜卧青霉 纤维素酶 合成调控 转录分析 蛋白质组 基因敲除
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q93
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