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IFN-γ对幽门螺杆菌和胃黏膜细胞作用及其机制的初步探讨

赵英会  
【摘要】:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是胃部感染最常见的病原微生物,全世界的平均感染率在50%左右,高发地区集中在东亚,包括我国还有日本和韩国。导致急慢性胃炎、胃溃疡、胃癌和胃黏膜相关性淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)等。1994年幽门螺杆菌被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)和国际癌症研究机构(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)列为Ⅰ类致癌因子。胃癌在所有的癌症中排在第四位,但致死率排在第二位,且预后不良。胃癌发生与幽门螺杆菌感染密切相关。 幽门螺杆菌感染宿主后引起胃炎过程中,会使体内Th1/Th2平衡偏向于Th1反应,导致大量Th1型细胞因子的产生,其中包括IFN-γ(Interferon-gamma)。IFN-γ是Th1反应中的关键分子,也是Th1反应中产生最多的免疫分子,是免疫活化的标志分子。正常情况下的人体组织或血清中不含有IFN-γ,只有在某些特定因素的刺激下才能诱导其产生。来源于临床标本和动物模型的证据显示幽门螺杆菌感染所致胃炎患者胃黏膜表面有高水平的IFN-γ。体外细胞试验也显示幽门螺杆菌或幽门螺杆菌的组分刺激细胞后,细胞产生IFN-γ,然而,细胞产生IFN-γ的机制尚未知。 对于IFN-γ在幽门螺杆菌感染引起的胃炎中所起的作用和起作用的机制,有研究者进行了研究。虽然Shimizu et al在儿童感染幽门螺杆菌的病例中发现IFN-γ和炎症细胞浸润没有关联,但Antonia et al发现成人感染幽门螺杆菌后具有高水平的IFN-γ且IFN-γ和单核细胞浸润有显著的联系。动物实验表明IFN-γ在幽门螺杆菌感染过程中可降低细菌粘附率,对于清除细菌具有重要的作用,所以IFN-γ起着保护性作用;但是若长期感染幽门螺杆菌,IFN-γ起着诱导胃炎的作用。单就IFN-γ对幽门螺杆菌所起的作用还未有研究,特别是IFN-Y在幽门螺杆菌感染引起胃癌中起作用及作用的机制少有研究。 胃癌发生发展过程中另一个重要的因素是胃癌细胞的增殖。有人报道癌细胞对IFN-γ不敏感,但大部分研究者持相反的观点。IFN-γ是一种致炎因子,IFN-Y在引起炎症的过程中起诱导作用,大部分研究显示它对癌细胞的增殖起负向调控作用。有报道称IFN-γ可以通过直接或间接地方式引起癌细胞的凋亡,如引起胃癌、脑胶质瘤、多发性骨髓瘤和宫颈癌等细胞的凋亡。它还可引起细胞的衰老、导致细胞周期变化、降低癌细胞的侵袭能力以及影响一些基因如编码促分泌剂3A1 (Secretoglobin 3A1, SCGB3A1)、骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、趋化因子CXCL10(IFN-γinducible protein-10, IP-10)等基因的表达、影响基因的修饰如信号传导子及转录激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT1)的磷酸化等。IFN-Y对胃癌细胞的衰老、细胞周期变化是否有影响,是否影响基因的表达,影响哪些基因的表达还未见报道。 幽门螺杆菌感染胃黏膜细胞后,幽门螺杆菌、宿主的免疫和胃癌细胞的增殖是胃癌发生发展的重要因素。有鉴于此,本研究首先探讨了幽门螺杆菌感染胃粘膜上皮细胞系胃癌细胞引起细胞产生IFN-γ的信号途径,然后从IFN-γ调节幽门螺杆菌的蛋白质表达和对胃粘膜上皮细胞系胃癌细胞的影响入手研究IFN-γ在幽门螺杆菌感染引起胃癌中所起作用及其机制。 一.幽门螺杆菌诱导胃粘膜细胞产生IFN-γ 细胞因子主要由免疫细胞产生,但随着研究的深入发现癌细胞和分泌细胞如黏膜细胞也能产生某些细胞因子。以前的研究显示感染幽门螺杆菌的胃黏膜具有大量的IFN-γ,除了免疫细胞产生的IFN-Y,我们通过体外细胞试验从RNA水平和蛋白水平证实胃癌细胞感染幽门螺杆菌后亦能产生IFN-γ。我们将幽门螺杆菌感染细胞后,幽门螺杆菌的主要毒力CagA (cytotoxin-associated gene A)阳性质粒转染胃癌细胞,胃癌细胞亦能产生IFN-γ。CagA (cytotoxin-associated gene A)阳性质粒转染胃癌细胞后,加入MEK/ERK、Src、P38和NF-KB的抑制剂,发现加入MEK/ERK、P38和NF-KB抑制剂后,IFN-γ的产生受到抑制,说明幽门螺杆菌刺激IFN-γ的产生依赖于这三者参与的信号途径。这有助于解释感染幽门螺杆菌的胃黏膜具有大量的IFN-Y。 二·IFN-γ影响幽门螺杆菌的蛋白质表达 幽门螺杆菌感染胃部后,受到酸、胆汁、盐和N0等人体环境因子的胁迫,会产生相应的反应。除了以上因素,幽门螺杆菌也暴露于人体的免疫环境中。免疫分子IFN-γ结合绿脓杆菌并上调其主要毒力,通过Blast比对,我们推测IFN-γ结合幽门螺杆菌,IFN-γ是否调节幽门螺杆菌的毒力表达值得探讨。我们首先把对数期的幽门螺杆菌暴露于IFN-γ中,发现IFN-γ不影响幽门螺杆菌的生长、增殖和形态变化。但是我们把对数期的幽门螺杆菌暴露于IFN-γ2h,用间接免疫荧光的方法发现IFN-γ结合于幽门螺杆菌的表面。然后我们用双向凝胶电泳技术获得幽门螺杆菌暴露于IFN-γ6h的蛋白质表达谱,发现IFN-γ可以影响该菌的某些蛋白表达,如参与DNA复制的蛋白、参与蛋白翻译和递呈的蛋白、压力蛋白等,其中还包括幽门螺杆菌的主要毒力蛋白CagA。 三.IFN-γ下调幽门螺杆菌的主要毒力蛋白CagA 在双向凝胶电泳结果的基础上,我们又用RT-PCR、实时荧光定量PCR以及Western Blot方法进一步验证了IFN-Y可以使幽门螺杆菌的主要毒力CagA下调。CagA是幽门螺杆菌的主要和重要毒力,它可以增加胃癌的风险。CagA被细菌的VI型分泌系统注入细胞,进入细胞的CagA有磷酸化和非磷酸化状态,磷酸化和非磷酸化状态都对细胞有损伤的功能,磷酸化CagA能引起细胞的蜂鸟状改变。所以我们把暴露于IFN-γ的幽门螺杆菌感染胃癌细胞,Western Blot鉴定细胞内的磷酸化和非磷酸化状态的CagA,并观察细胞形态的变化。结果发现幽门螺杆菌暴露于IFN-γ后再感染细胞,细胞内的磷酸化和非磷酸化状态的CagA都下降,细胞的蜂鸟状改变的比率也下降。因为磷酸化CagA可以使鼠特异性的发展成胃肠肿瘤,所以我们的试验体外证明了IFN-Y下调幽门螺杆菌的主要毒力蛋白CagA,且具有细胞生物学效应,从而降低胃癌的风险。 四. IFN-Y对胃黏膜细胞的影响及作用 胃癌细胞暴露于免疫分子IFN-γ,作为重要的免疫活化分子,IFN-γ主要通过免疫系统间接起抗癌作用。但是近来研究显示IFN-γ可以直接对癌细胞有负向的调控作用。IFN-Y能引起胃癌细胞的凋亡,它是否引起胃癌细胞其它的变化值得研究。我们首先把胃癌细胞暴露于IFN-γ中,做了克隆形成实验,发现IFN-Y降低了细胞的克隆形成能力。通过流式细胞术发现对胃癌细胞的凋亡没有影响,通过β-gal染色发现对细胞的衰老也没有影响。所以我们通过基因芯片技术检测了胃癌细胞暴露于IFN-γ的基因表达谱,发现IFN-γ可以引起某些基因的表达变化,如与细胞周期相关蛋白的基因等。最后通过流式细胞术我们发现IFN-Y可以引起胃癌细胞大部分停留于G0/G1期。据此IFN-Y可能通过使胃癌细胞周期停滞而降低胃癌细胞的增殖能力,所以IFN-γ在胃癌的发展过程中起抑制作用。 总之,本研究通过从IFN-γ下调幽门螺杆菌的主要毒力和对胃癌细胞的增殖抑制作用两方面,从体外证明了IFN-γ在幽门螺杆菌引起的胃癌的发展中起抑制作用,对感染幽门螺杆菌的宿主是有利的,可以考虑把IFN-γ作为临床药物来辅助治疗幽门螺杆菌感染导致的胃癌,当然这需要在动物实验和临床上进一步验证。


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