收藏本站
《山东大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

盐芥TsVP启动子核心区域的鉴定及其上游调控蛋白的功能分析

孙清华  
【摘要】:对高等植物非生物胁迫应答的分子机制的研究具有重要的意义。拟南芥是一种典型的甜土植物,它在耐盐耐早机制研究方面有其自身的局限性。盐芥是拟南芥的近缘种,是一种高度耐盐耐旱的盐生植物,且具有基因组小,cDNA序列与拟南芥相似程度高等优点,已成为人们研究植物非生物胁迫响应的模式植物。 基因表达调控发生在染色体、转录、转录后、翻译、翻译后多个水平上,其中转录水平的调控尤为重要。启动子作为控制基因转录的顺式作用因子调控基因转录的起始,在基因表达调控中发挥重要作用,而且其调控作用的实施需要转录因子蛋白的参与。本研究以盐芥液泡焦磷酸酶基因TsVP的启动子为实验材料,通过对该启动子核心元件的鉴定及其上游结合蛋白的功能分析,揭示了TsVP基因对盐胁迫诱导响应的部分机制。 本实验室高峰等发现,尽管在酵母和烟草中过表达TsVP和AVP1都可以提高宿主的耐盐性,但它们在盐胁迫条件下表达模式不同:TsVP的表达受盐胁迫诱导,而AVP1则对盐诱导不发生反应。为了研究造成这种差异的原因,本工作克隆出这两个基因的启动子区域并进行生物信息学分析,发现二者在顺式作用元件的种类,数量以及分布存在明显的差异。 为了较深入了解TsVP启动子的结构和特性,构建了一系列的5’端缺失突变体,将它们分别与报告基因gus连接,用于转化拟南芥。在转基因拟南芥中,全长TSVP启动子(2200bp)在正常条件下高强度启动报告基囚的表达,其GUS表达强度与CaMV 35S启动子驱动的GUS表达强度差异不大;在盐胁迫下,其GUS表达活性在根部和叶中受到明显的诱导作用,升高到未胁迫时的3倍左右。PT1(全长TsVP启动子连接GUS报告基因)和PA1(全长AVP1启动子连接GUS报告基因)在正常生长条件下具有相似的表达模式,几乎在种子外的每一个组织中都具有活性。但在盐胁迫处理后,PT1在根、叶中的表达受到明显的诱导,在根部高强度表达主要出现在根尖处,而在PA1中未发现这种诱导现象。PT1启动子的高驱动能力表明该启动子在植物基因工程中有很好的应用价值。 在5’系列缺失突变体中,PT2与PT1相比缺少了一段856bp的区域(-2200至-1344),导致PT2的活性要明显低于PT1的,我们推测在-2200到-1344这段区域存在着可以明显提高启动子活性的增强子元件。此外,PT2在花中表现出明显的花药特异性表达模式。这种表达模式同样出现在缺失突变体PT3到PT6的转基因植株中,但在PT7到PT9中消失。我们推测一个AAATGA元件可能在花的花药特异表达模式中起关键作用。 通过对系列缺失突变体在正常条件以及盐胁迫条件下的GUS基因表达分析,最终鉴定得到一段130bp(-667至-538)的核心序列。该序列对于TsVP启动子的盐胁迫诱导响应具有重要的作用。农杆菌介导的烟草叶片GUS瞬时表达分析也表明这130bp区域可以很好的响应盐胁迫环境。在该区域尚未发现与盐胁迫响应相关的已知作用元件,因此对该区域进行进一步分析,找到其中存在的核心序列,并找到调控该元件的功能蛋白,无疑具有重要的学术意义。 以这段核心序列为诱饵,通过酵母单杂交系统筛选得到了与之相互作用的两个蛋白,命名为TsNacl和TsVOZ1。 TsNac1的ORF全长918bp,与拟南芥RD26(AT4G27410)具有86%的核苷酸相似性,92%的氨基酸相似性。RT-PCR检测表明,TsNac1基因在正常生长条件下的表达量在根中远小于叶中的,但在盐胁迫、干旱胁迫和ABA处理后,根中表达量的变化幅度高于叶中的。TsNac1基因的表达受盐胁迫、干旱胁迫和ABA胁迫的诱导。在这三种胁迫条件下该基因表达强度的变化幅度有不同,对ABA诱导的响应最明显,尤其是在根中,处理12小时后其表达量上升了1000多倍。在盐胁迫条件下TsNac1基因的表达水平可上调60多倍,而对干旱诱导的响应相对较弱,尤其在叶中。这些结果表明该基因有可能是盐芥耐盐机制的重要成员,与ABA信号传导有重要联系。 构建TsNac1原核表达载体并转化大肠杆菌BL21,诱导转化菌表达重组蛋白。利用已获得的TsNac1重组蛋白,与上述130bp的启动子序列进行体外结合试验。EMSA试验的结果表明,TsNac1蛋白可以很好的与该片段在体外结合,而且这种结合具有良好的特异性。 鉴于TsNac1与TsVP启动子中的盐诱导响应区域特异性结合,而且其本身的表达受到盐、干旱以及ABA的诱导,推测TsNac1很可能就是我们要寻找的调控TsVP表达的上游转录因子,对其进行深入研究以揭示TsNac1的生物学功能以及其调控的下游基因网络具有重要的意义。 通过在拟南芥中过表达和抑制表达TsNac1,初步分析了该基因在植物耐盐性方面的作用。TsNac1基因的过表达提高了转基因拟南芥的耐盐性,而抑制该基因则明显增加了转基因拟南芥的盐敏感性。 鉴定TsNac1在TsVP启动子上的结合位点可以为了解其作用机制提供有价值的参考资料,也可以为植物基因工程改良提供具有使用价值的启动子元件,因此鉴定TsNac1在TsVP启动子上的靶位点具有重要的意义。利用不同的过量非标记竞争性DNA来竞争标记DNA与TsNac1蛋白的结合,鉴定出一段20bp的DNA序列(GAATATACCATGGA TAAGC A)为该蛋白的结合位点。在这段DNA序列中包含CATG元件。目前认为NAC家族蛋白的结合位点为CACG,但是Trans等研究表明拟南芥中NAC家族的蛋白也可结合一段MYC-like CATGTG位点。推测CATG可能是TsNac1蛋白结合的核心位点,其结合也需要周围的几个甚至十几个核苷酸序列。 利用CHIP-on-chip技术对该蛋白在拟南芥染色体中的结合位点进行了详细的分析,并利用RT-PCR对实验结果进行了验证。结果表明在拟南芥中该蛋白与284个基因的启动子区域有结合作用,这284个基因参与了众多的生物学过程,包括了代谢,发育,细胞定位,刺激响应,生殖,蛋白磷酸化,氧化还原等生物学过程。值得注意的是在这284个基因中,有大约70个属于转录因子类基因,占25%左右,而拟南芥中转录因子只占全部基因数量的5%左右。也就是说在TsNac1的靶基因中,转录因子所占的比例大概是正常比例的5倍,而且其靶基因中包括了像DREB这种公认的与植物抗逆有关的转录因子,这也表明在TsNac1基因在植物抗逆中的重要调控作用。此外该基因还可以通过调节一些小分子转运体基因,结构基因以及一些结合蛋白基因的表达来调控下游功能基因的表达,而且该基因也可以直接调控一些功能基因的表达水平。这些结果表明TsNac1在基因调控网络中应该处于一个较为上游的位置。此外,TsVP在拟南芥中的同源基因AVP1并不在这些靶基因中,通过前面启动子分析的工作我们知道AVP1虽然属于抗逆相关基因,但是其本身的表达并不受盐胁迫的诱导,这一结果表明TsNac1并没有参与AVP1基因的调控,这与我们的预期是相符合的。 另外,利用酵母单杂交系统还鉴定出与基于TsVP启动子构建的诱饵相结合的TsVOZ1蛋白。该蛋白与拟南芥中的AVOZ1具有85%的核苷酸相似性,90%的氨基酸相似性,其表达受盐胁迫的诱导,但是却不受干旱以及ABA的诱导,而且其受盐胁迫响应的程度远不如TsNac1明显。根据Mitsuda N等人对AVOZ1的研究结果,我们在TsVP启动子区域中,我们找到了一段GCGTNx7ACGC回文序列,即GCGTCGGCTGCACGC (-274到-259),但是这段序列并不在上述我们鉴定得到的130bp核心序列中。通过在拟南芥中对TsVOZ1基因进行过表达和抑制表达,得出TsVOZ1的过表达以及基因敲除并没有明显影响转基因拟南芥的耐盐性。TsVOZ1虽然与该启动子有结合,然而并没有参与该基因盐胁迫响应的调控。 这些工作通过对盐芥中TsVP启动子及其上游调控蛋白的功能分析,不仅为植物基因工程提供具有自主知识产权的调控元件和耐盐基因,而且为植物盐胁机制的深入探讨提供了新资料,可望为我国大面积盐碱地的开发利用做贡献。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q943.2

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 路子显,常团结,刘翔,朱祯;植物碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白的研究进展(一)——结构、分类、分布和同源性分析[J];遗传;2001年06期
2 杨致荣,王兴春,李西明,杨长登;高等植物转录因子的研究进展[J];遗传;2004年03期
3 陈丽;植物转录因子的结构与功能[J];植物生理学通讯;1997年06期
4 桑新华,吴忠义,黄丛林,张潞生;植物逆境抗性相关转录因子的研究进展[J];植物学通报;2004年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张学成;郭楠;宋晓金;;藻类基因启动子结构与功能研究进展[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2008年03期
2 吴蔼民,刘进元;Analysis of the Cotton E6 Promoter[J];Tsinghua Science and Technology;2005年04期
3 李萍,陈峰,全超,张贵友;OsDREB1 Gene from Rice Enhances Cold Tolerance in Tobacco[J];Tsinghua Science and Technology;2005年04期
4 谢永丽;王自章;张淑平;;DREB——一类应答植物非生物逆境胁迫的转录因子[J];青海大学学报(自然科学版);2006年02期
5 李美茹,刘鸿先,王以柔;植物抗冷性分子生物学研究进展(综述)[J];热带亚热带植物学报;2000年01期
6 胡廷章;植物基因环境效应启动子[J];重庆三峡学院学报;2002年05期
7 韩多红;徐咸虎;温玉峰;李兴平;;河西走廊野生盐生可食植物及其开发利用[J];蔬菜;2011年03期
8 张侠;宋莉璐;魏艳丽;任艳;朱娇;李红梅;李纪顺;杨合同;;NaCl胁迫对三叶草种子萌发的影响[J];山东科学;2008年05期
9 李丽娟;赵奂;李艳军;刘祥林;何奕昆;;植物中的DREB类转录因子[J];首都师范大学学报(自然科学版);2006年05期
10 米东,李海权,李建粤,陈立琼;总蛋白含量不同的水稻品种谷蛋白含量分析及Gt1启动子序列比较[J];上海师范大学学报(自然科学版);2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王海光;李自超;;植物干旱胁迫应答基因及其产物研究进展[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
2 王巧燕;陈明;邱志刚;程宪国;徐兆师;李连城;马有志;;一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定[A];2005年全国作物遗传育种学术研讨会暨中国作物学会分子育种分会成立大会论文集(二)[C];2005年
3 沈洪波;陈学森;;果树抗寒生理及抗寒性遗传育种研究进展[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
4 张兴国;邵长文;孙涌栋;苏承刚;;基因Cor15A和CBF3导入黄瓜基因组[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
5 张兴国;邓小燕;邵长文;孙涌栋;梅茜;苏承刚;;CBF3和Cor15A基因导入黄瓜[A];中国园艺学会第六届青年学术讨论会论文集[C];2004年
6 王鹏;汪李平;;水杨酸与植物的抗冷性[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
7 张秦英;;草甸景观与盐碱地绿化[A];中国观赏园艺研究进展(2010)[C];2010年
8 田宏;刘洋;张鹤山;蔡化;张年;陈明新;;盐胁迫对扁穗雀麦种子萌发特性的影响[A];中国草学会饲料生产委员会第15次饲草生产学术研讨会论文集[C];2009年
9 窦超银;康跃虎;;地下水浅埋区重度盐碱地覆膜咸水滴灌水盐动态试验研究[A];纪念中国农业工程学会成立30周年暨中国农业工程学会2009年学术年会(CSAE 2009)论文集[C];2009年
10 ;Cold stress-induced Transcriptome Changes in cassava(Manihot esculenta Crantz) by Long Oligonucleotide Microarray[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范锐;脐橙(Citrus sinensis Osbeck)果实采后商业贮藏中基因表达的芯片分析及候选基因的表达验证[D];华中农业大学;2010年
2 曹银川;柑橘NAC转录因子的克隆与表达分析[D];华中农业大学;2010年
3 詹菁;百合AGAMOUS同源基因的克隆、载体构建及遗传转化[D];华中农业大学;2010年
4 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
5 姚秋林;水稻根特异表达启动子的克隆及功能分析[D];华中农业大学;2010年
6 黄聪;花生中DREB、bZIP类转录因子耐逆性研究[D];哈尔滨师范大学;2010年
7 徐红明;小麦抗白粉病相关基因的克隆与分析[D];郑州大学;2010年
8 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
9 于丽萍;玉米种子胚特异性启动子emb5的功能分析[D];山东农业大学;2010年
10 洪艳艳;黄瓜液泡膜H~+-PPase基因的cDNA克隆与表达分析[D];山东农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 路子显,常团结,刘翔,朱祯;植物碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白的研究进展(一)——结构、分类、分布和同源性分析[J];遗传;2001年06期
2 陈俊,王宗阳;植物MYB类转录因子研究进展[J];植物生理与分子生物学学报;2002年02期
3 陈丽;植物转录因子的结构与功能[J];植物生理学通讯;1997年06期
4 沈义国,闫冬青,张万科,杜保兴,张劲松,刘强,陈受宜;山菠菜EREBP/AP2类DNA结合蛋白基因的克隆及其耐逆性研究(英文)[J];Acta Botanica Sinica;2003年01期
5 秦峰,李洁,张贵友,赵军,陈受宜,刘强;玉米中与DRE元件结合的转录因子的克隆和结构分析(英文)[J];Acta Botanica Sinica;2003年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;基因标记、转化、表达与检测[J];生物技术通报;1992年07期
2 陈浩;杨健;王跃祥;蒋璆;徐绘;宋后燕;;卵黄蛋白原1(vtg1)启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼的构建[J];生物化学与生物物理进展;2006年10期
3 佟小雪;牛丹丹;陈献忠;石贵阳;王正祥;;地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究[J];生物技术;2009年05期
4 李有文;魏风;陈创夫;王远志;张辉;任艳;郭志儒;;山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株表达载体的构建[J];中国兽医学报;2011年09期
5 王云;叶向群;吴亦亮;桂慕燕;左正宏;;四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达[J];昆虫学报;2006年02期
6 ;基因标记、转化、表达与检测[J];生物技术通报;1993年02期
7 蔡亚君;袁志明;胡晓敏;韩蓓;;几丁质酶ChiAC不同时期表达对苏云金杆菌的影响[J];生物技术;2011年02期
8 王军卫;张改生;张晓东;;脱水应答转录因子CBF1的克隆与转基因小麦的分子检测[J];西北植物学报;2008年02期
9 董绍旺;王爱英;孙建富;沈海涛;祝建波;;转P_(rd29A)-ipt基因对烟草根及侧芽生长的影响[J];生物技术通报;2010年08期
10 ;植物遗传工程[J];生物技术通报;1993年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张俊;;hTERT启动子调控hNIS基因介导肺癌细胞碘摄取和治疗的初步实验研究[A];第四届全国中青年核医学学术会议论文汇编[C];2008年
2 刘晓艳;方红;;CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
3 梁惠玲;Lohn Lunec;;mdm2癌基因中受P53抑制的新启动子的发现[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
4 李桂英;孙红光;朱迅;杜柏榕;;L-plastin启动子调控下p16基因的表达有效抑制MCF-7细胞的增殖[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
5 李青春;梁淑娟;刘艳艳;王焕芹;肖伟玲;张素华;;AFP启动子调控的IL-1β表达对肝癌细胞生物学行为的影响[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
6 颜次慧;杨铭;李真真;熊冬生;;AFP启动子调控下TRAIL在脐带间充质干细胞中的特异性表达[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
7 张春丽;李玲;康磊;卢霞;张丽;闫平;王荣福;;放射敏感性启动子调控CD基因表达联合~(125)I照射对膀胱癌EJ细胞的杀伤作用[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
8 赵祯;黄蕤;匡安仁;;Survivin启动子调控hNIS基因介导肿瘤核素显像和治疗的基础研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
9 马蕾娜;钱程;;单一polⅡ启动子调控抗环氧化酶-siRNA和TRAIL蛋白对肝癌的协同治疗[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
10 曹伟军;张桂英;;hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT对人胃癌细胞的靶向性杀伤作用[A];中华医学会第11届全国内科学术会议论文汇编[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 张小军;拟南芥基因组被完整破译[N];新华每日电讯;2000年
2 ;科学家看上拟南芥植物基因[N];中国环境报;2000年
3 张田勘;揭开植物生长的奥秘[N];河北日报;2001年
4 通讯员 陈胜伟 记者 叶辉;我成功克隆到将植物脂肪转化为糖类的基因[N];光明日报;2010年
5 记者 吴伟农;美把拟南芥列为植物基因研究重点[N];新华每日电讯;2000年
6 李山;植物拥有防止危险突变的保护机制[N];科技日报;2009年
7 李星星 本报记者 房琳琳;李家洋:寻求遗传发育的哲学灵光[N];科技日报;2004年
8 美国《连线》 王金元 译;太空种植以备长居太空[N];北京科技报;2008年
9 付毅飞;给基因装上“开关”[N];科技日报;2004年
10 张田勘;安全转基因食品让人类安心[N];大众科技报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙清华;盐芥TsVP启动子核心区域的鉴定及其上游调控蛋白的功能分析[D];山东大学;2011年
2 曾卫军;拟南芥(Arabidopsis thaliana)受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究[D];华东师范大学;2011年
3 戴灿;细胞分裂周期相关基因CDCA8启动子的功能研究[D];中南大学;2010年
4 李燕;紫花苜蓿诱导表达启动子MsZPP的克隆及功能分析[D];中国农业科学院;2012年
5 徐伊琳;黑色素瘤抑制因子2(MIA_2)与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性研究[D];武汉大学;2010年
6 杨广哲;油菜缺磷诱导表达基因BnSPX3和BnIPS1及其启动子的分离与鉴定[D];华中农业大学;2011年
7 叶荣建;水稻组织特异表达启动子的分离克隆、功能分析及应用[D];华中农业大学;2012年
8 杨应斌;人骨髓干细胞源性恶性转化细胞的靶向清除[D];重庆大学;2010年
9 杨艳明;乏氧/辐射双敏感启动子介导shTRAIL联合放射治疗肺癌的体外抑瘤效应研究[D];吉林大学;2010年
10 王澎;hTERT启动子调控hNIS和hTPO基因联合转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究[D];天津医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 舒曦;水稻CPR5基因和启动子的克隆及表达分析[D];华南理工大学;2010年
2 郭正红;启动子对蓝藻中外源egfp基因表达的影响[D];上海师范大学;2010年
3 赵蕾;盐芥TsNPT启动子的功能分析及其上游结合蛋白的克隆[D];山东大学;2010年
4 张鹏;hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
5 李尉;水稻OsWTF1和OsWTF2启动子功能分析[D];湖南农业大学;2010年
6 孙家利;烟草rbcS启动子的克隆及转SLC1-1基因烟草的研究[D];河南农业大学;2010年
7 曾小林;亚洲棉GaP5CS和GaTPS基因启动子的克隆与功能分析[D];中国农业科学院;2010年
8 王俊姝;大肠杆菌操纵子改造及其应用初步研究[D];山东大学;2010年
9 张衡;CK19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
10 韩明鲲;人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子的克隆及其在喉癌基因治疗中的意义[D];第四军医大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026