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《山东大学》 2011年
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肝脏γ-氨基丁酸能系统对大鼠急性肝功能衰竭的改善作用及其机制研究

王双连  
【摘要】:目的:已有文献报导,在肝脏中可检测到较高浓度的γ-氨基丁酸(GABA)并且在肝细胞中存在一些GABAA受体亚单位。本研究试图进一步证明肝脏内存在GABA能系统,并探讨该系统在改善大鼠急性肝衰竭中的作用及其机制。 方法:反转录多聚酶链反应(RT-PCR)、Western Blot分析、荧光免疫组织化学染色和全细胞膜片钳记录方法用于检测GABA受体亚单位和催化GABA合成的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)在肝细胞中的表达及分布。采用D-氨基半乳糖(D-galactosamine, GalN)腹腔注射的方法建立大鼠急性肝衰竭动物(acute liver failure, ALF)模型,同时利用培养的原代大鼠肝脏细胞观察研究GABA受体激动剂对ALF的改善作用及其相关机制。 结果: 1.利用RT-PCR方法在大鼠肝脏组织中检测到了GAD67和α1、α3、β2、β3、δ、π等GABAA受体亚单位mRNA的表达;Western Blot分析也检测到了催化GABA合成的GAD65和GAD67(GAD65/67)以及GABAA受体β3亚单位的蛋白表达。荧光免疫组织化学染色显示,GAD65/67主要表达于中央静脉周围的肝细胞胞浆,而GABAA受体β2和β3亚单位(β2/3)则分布在肝细胞膜上。荧光免疫组织化学染色还发现GABAB受体的GABABR lb也存在于大多数肝细胞的细胞膜上和胞浆中。以上结果提示肝脏中存在一个完整的GABA信号系统。 2.利用离体培养的Clone 9正常大鼠肝细胞系和WITT人类胆管癌上皮细胞系做全细胞膜片钳记录。在被记录的56个Clone 9田胞中,17个细胞产生GABA(1mM)诱导的、可被GABAA受体选择性阻断剂苦味毒(picrotoxin, PTXN)所阻断的快速内向电流,幅度为3.2 pA±0.24 pA。经GABA (10μM)处理12h~18 h后,WITT人类胆管上皮细胞的静息膜电位由-25.16 mV±2.94 mV(n-24)去极化到了-16.53 mV±1.64 mV(n=14)。在记录的78个WITT细胞中,有12个细胞可以记录到GABA(200μM)诱导的、可被GABAA受体选择性阻断剂PTXN所阻断的快速内向电流,在这12个细胞中,有4个细胞记录到了幅度较大的“位相性”(phasic)电流,幅度为13.2 pA±0.43 pA,有8个细胞记录到了幅度较小的“张力性”(tonic)电流,幅度为3.27 pA±0.39 pA。以上结果证明肝脏细胞中GABAA受体亚单位组成有功能的GABAA受体。 3.向大鼠腹腔注射GABA或GAD选择性阻断剂L-allylglycine (L-AG)并没有显著改变大鼠肝功能,大鼠的体重增加值、血糖水平、肝脏组织学以及血清总胆红素、ALT、AST水平与生理盐水对照组相比均没有显著性差异。 4.利用腹腔注射0.83 g/kg氨基半乳糖(D-galactosamine, GalN)构建大鼠ALF模型。与(盐水)对照组相比,ALF组(GaIN+盐水组)大鼠体重增加量为对照组的52.28%±25.95%(n=4,P0.05);HE染色可见肝组织坏死;PAS(periodic acid-Schiff)染色显示肝组织中糖原储存量减少,其血糖浓度仅为对照组的77.43%±5.71%(P0.05)。肝功能检查显示ALF组血清总胆红素、ALT和AST水平跟对照组相比均显著增加(对照组血清总胆红素、ALT和AST浓度分别为1.30μM±0.40μM、55.00 IU/L±6.26 IU/L和112.38 IU/L±11.73 IU/L;ALF组血清总胆红素、ALT和AST浓度分别为34.40 gM±9.43μM、129.33 IU/L±45.10 IU/L和253.00 IU/L±51.02 IU/L,P0.05)。 5.腹腔注射GABA显著改善GalN引起的肝损害。与ALF组大鼠相比,GABA干预组(GalN+GABA)大鼠体重增加量显著增高(GalN+GABA组为77.45%±7.93%,ALF组为52.28%±25.95%,P0.05);GABA干预组大鼠肝组织坏死程度得到明显改善,PAS染色显示肝脏中糖原储存量和血糖浓度显著高于ALF组(GABA干预组为86.13%±4.35%,ALF组为77.43%±5.71%,P0.05)。TUNEL染色结果提示GABA还可抑制ALF大鼠肝细胞发生凋亡。与ALF组相比,GABA干预组大鼠血清总胆红素、ALT和AST水平均降低(GABA干预组血清总胆红素、ALT和AST浓度分别为2.26μM±0.79 gM、57.86 IU/L±6.84 IU/L和155.29 IU/L±29.53 IU/L,P0.05)。腹腔注射GABAA受体特异性激动剂剂蝇蕈醇(muscimol, MUS)对大鼠ALF的改善作用与GABA相似,而GABAB受体特异性激动剂巴氯酚(baclofen)对ALF没有明显的改善作用。 6.ALF大鼠肝组织中催化GABA合成的GAD65/67蛋白表达量增多,而GABAA受体p3亚单位的蛋白表达量则减少;参与解氨毒的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)表达水平则减少。这三种蛋白的表达变化均可被MUS反转,但不被baclofen所反转。与正常对照组相比,ALF组大鼠肝脏中磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)、磷酸化的Akt(p-Akt)、磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β)表达量均降低(P0.05),上述3种蛋白在MUS干预组(GalN+MUS组)大鼠肝脏组织中的表达水平均高于ALF组(GaIN+盐水组)(P0.05)。 7.免疫组化(标记NeuN)发现ALF组大鼠大脑皮层及海马CAl区的锥体神经元发生核固缩(盐水对照组细胞核直径为17.24μm±0.64μm,n=12;ALF组为11.58μm±0.66μm,n=7,P0.05),提示ALF导致的脑神经元损伤。MUS干预组(GalN+MUS组)大鼠海马CAl区的神经元形态未见明显异常(细胞核直径为16.41 gm±0.63μm,n=8,与ALF组相比有统计学差异)。、VesternBlot显示ALF组大鼠大脑皮层组织中GAD65/67和GS的表达水平跟盐水对照组没有统计学差异。GABAA受体特异性激动剂MUS和GABAB受体特异性激动剂baclofen对ALF大鼠皮层组织中的GAD65/67和GS表达水平均没有显著影响。 8.利用原代培养的大鼠肝细胞进一步发现,GalN对原代培养肝细胞的毒性作用表现为破坏细胞的形态结构,降低其存活率,诱导肝细胞凋亡,GABA和MUS则可保护肝细胞免受GalN导致的损害。 结论:1)大鼠肝脏中存在GABA能系统,可能通过自分泌或旁分泌的形式调控肝脏和胆道系统的生理功能。2)激活该系统可保护肝细胞免于GalN导致的损害。3)该保护作用可能通过GABAA受体-PI3K-Akt-GSK3β信号转导通路实现。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R575.3

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【引证文献】
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