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N-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖核苷酸及类似物的酶法合成与应用研究

关婉怡  
【摘要】:糖类(包括单糖、寡糖和多糖)及糖缀合物广泛存在于从低等的细菌到高等的动植物等所有生物体中,不仅是重要的结构组分,而且作为信息分子在许多关键的生物过程中发挥着不可替代的作用。糖链结构的特定改变与特定的病理状态(如炎症和肿瘤)密切相关,表明糖链在临床诊断中的应用潜力和作为药物研发靶标的可能性。 N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)两种N-乙酰氨基己糖是常见的单糖,它们是细菌细胞壁骨架和糖胺聚糖的重要组分,也存在于糖蛋白、糖脂糖链的核心结构中,还影响着分子间(如可通过蛋白的O-GlcNAc糖基化修饰调控信号转导途径)或细胞间(如GalNAc存在的糖脂影响细胞相互作用、细胞分化等过程)的相互作用。研究含有这两种单糖的寡糖、多糖及糖缀合物,可以辅助人们了解生理、病理过程和研发药物。 细菌表面包被有结构复杂的多糖,其中脂多糖(LPS)和荚膜多糖(CPS)均为共价连接于细胞表面,都由多个重复单元组成,都具有高度的结构多样性,也都是细菌致病的重要的毒力因子。一些细菌的CPS还具有与人类自身的多糖相同或相似的结构。研究这两种细菌表面多糖及它们的生物合成过程,既有助于开发细菌感染性疾病的预防和治疗方法,又有助于用低成本的方法生产无致病病毒污染的多糖。 研究糖链的生物功能,就要获得结构均一且明确的含糖化合物。由于从生物来源分离的糖或糖缀合物的糖链结构具有微不均一性,化学合成操作复杂、收率比较低,而生物体内糖链合成途径中的糖基转移酶可以高效合成区位特异性和立体特异性的糖苷键,所以用糖基转移酶(主要是Leloir型糖基转移酶)合成结构均一的糖链已成为有机化学合成糖链的有效替代途径。不过,有机化学合成在合成非天然糖方面具有优势,可以为天然化合物提供结构多样的衍生物,为药物开发提供更多可能的靶标;非天然糖也可能带有易于进一步标记的基团,可以促进对糖类代谢的研究。将化学合成的灵活性与酶法合成的高效高特异性结合(即化学酶法合成),就有可能实现糖的结构类似物的高效合成,是近年来广泛应用于糖生物学研究领域的重要手段。 糖核苷酸是单糖的异头碳与核苷二磷酸或核苷一磷酸连接形成的衍生物,是单糖的活化形式。糖核苷酸作为糖基转移酶催化的转糖基反应的糖基供体,是生物体合成糖链和糖缀合物必需的前体;天然糖核苷酸的结构类似物还可能作为酶的抑制剂或作为研究分析糖缀合物生物合成途径的工具,因此,高效地制备天然和非天然的糖核苷酸对生物化学及药物化学研究意义重大。生物体内糖核苷酸的补救合成途径步骤少,操作简单,是酶法合成糖核苷酸常用的合成路线。 UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc分别是GlcNAc和GalNAc的糖基供体,在生物体内,它们都可通过几种途径合成,也包括补救途径。在补救途径中,GalNAc可以在GalNAc1-位激酶和UDP-GalNAc焦磷酸化酶的先后作用下被转化为UDP-GalNAc,以往的报道所用的酶都是来源于哺乳动物的。而GlcNAc要经过GlcNAc激酶.GlcNAc磷酸变位酶和UDP-GlcNAc焦磷酸化酶三个酶依次作用,才被转化为UDP-GlcNAc。缺少GlcNAc1-位激酶导致很难用酶法合成GlcNAc-1-P这一合成UDP-GlcNAc的关键中间体,也导致GlcNAc-1-P价格昂贵,还限制了GlcNAc-1-P结构类似物的酶法合成,制约了以GlcNAc-1-P及其类似物为实验材料的研究工作的开展。糖核苷酸也是价格昂贵的实验材料,对研究有重要意义的糖核苷酸结构类似物还无法从商业途径获得,因此,大量合成糖核苷酸及其结构类似物也是糖生物学领域的一个研究热点。 本论文的目标之一是解决酶法合成GlcNAc/GalNAc-1-P及其结构类似物的问题,并进而实现UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物的酶法合成。来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(NahK)是文献中报道的第一个GlcNAc1-位激酶,可以将GlcNAc一步磷酸化成GlcNAc-1-P;它对GlcNAc和GalNAc具有相近的反应速率,也可以看作GalNAc1-位激酶,是第一个来源于细菌的具有该活性的酶;它对ManNAc也有一定活性,说明这个酶对底物结构的要求比较宽松。论文第二章克隆了NahK,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中以C端带有His6标签的融合蛋白形式过量表达,经过Ni柱和分子筛层析纯化后,重组NahK纯度可达到95%以上。我们综合考虑了糖的侧链基团的空间位阻、羟基的键型、脱氧,以及便于进一步反应等因素,设计了C2-,C3-,C4-和C6-位有结构变化的GlcNAc/GalNAc结构类似物,试验NahK对它们的活性。包括GlcNAc和GalNAc在内,一共试验了25种糖,其中的19种被NahK转化成相应的1-磷酸糖并用硅胶柱层析分离得到产物,收率达到60%以上的有14种。除了试验NahK对GlcNAc/GalNAc结构类似物的活性,γ位带S原子的ATP也被用于NahK的反应,且产物收率和ATP为磷酸供体时的收率相当,说明这个S原子没有对NahK的反应产生太大影响。利用NahK的反应和硅胶层析法,GlcNAc-1-P的合成成本大大降低;而NahK表现出的广泛的底物特异性又使它可以用于GlcNAc/GalNAc-1-P结构类似物的制备,为UDP-GlcNAc/GalNAc结构类似物的酶法合成奠定了基础。 第三章在第二章制备的1-磷酸糖的基础上,克隆了来源于大肠杆菌的GlmU (UDP-GlcNAc焦磷酸化酶)和来源于人的AGX1 (UDP-GalNAc焦磷酸化酶),分别用大肠杆菌重组表达为N端带His6标签的融合蛋白。用Ni柱和分子筛层析纯化后,两种酶均有活性,但它们表现出不同的底物特异性。天然底物为GlcNAc-1-P的GlmU对试验中用到的大部分GlcNAc构型的糖-1-P衍生物具有活性,即使C2-位没有酰胺基,在延长反应时间时,也以中等收率合成出糖核苷酸。但它对GalNAc构型的糖-1-P衍生物的活性有限,只对C4-和C6-位修饰的衍生物表现出一些活性。而对GalNAc-1-P的活性高于对GlcNAc-1-P的AGX1对实验用到的大多数GlcNAc/GalNAc-1-P结构类似物表现出较高的活性。另外,含s原子的糖-1-P被GlmU转化为相应的糖核苷酸,产物可以用于糖基转移酶性质的研究。利用离子交换和分子筛层析法,我们分离得到了UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物,它们可以用于糖基转移酶等酶的性质研究和糖链结构类似物的制备,而且我们建立了一种比较简便的制备非天然糖核苷酸的方法。 研究糖基转移酶的性质,传统的方法需要对待测分子进行放射性或荧光标记,还需要将分子分离出来才能检测。在本论文第四章,我们建立了一种新的分析糖基转移酶性质的方法(SAMDI MS)。这种方法将自组装单分子层(SAMs)和MALDI-TOF MS结合起来,不需要标记待测分子,用较短时间、仅消耗微量样品,即可通过反应液的质谱结果定性、定量地分析糖基转移酶催化的反应。以来源于脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的β1,3-GlcNAc转移酶LgtA为例,我们用SAMDI MS法分析了该酶的底物特异性,并测定了供体底物的动力学参数,展示了该方法在糖基转移酶性质研究中的应用前景。 GlcNAc/GalNAc存在于许多具有重要生理功能的糖结构(如糖蛋白、肽聚糖和糖胺聚糖)中,越来越多的研究关注于利用化学修饰的非天然糖取代多糖中的GlcNAc/GalNAc残基和调节这些糖苷的功能。论文第五章向大肠杆菌培养基中添加了2-ketoGlc (GlcNAc结构类似物),用可发生化学选择性反应的试剂在菌体表面和细菌LPS核心寡糖中检测到了含有酮基的糖,证明2-ketoGlc可以通过体内整合到大肠杆菌的表面多糖中,从概念上证明了除了岩藻糖衍生物,其他特定的单糖衍生物也可以被整合入细菌表面的多糖。但由于2-ketoGlc有多种可能的代谢途径,尚没有精确地确定出核心寡糖中被修饰的残基。透明质酸(HA)在美容、医药等领域广泛应用,对它的改造往往通过化学修饰进行。A型巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的CPS具有透明质酸的结构,我们尝试用A型巴斯德氏菌的透明质酸合酶(PmHAS)的可溶段为工具酶,以带有生物正交基团的非天然糖核苷酸(UDP-2-ketoGlc)直接合成HA的衍生物。可能由于检测方法灵敏度不高,或者UDP-2-ketoGlc无法被PmHAS(T)利用,在产物HA中没有检测到酮基。进一步的研究仍在进行中。 总之,本论文应用两种来源于细菌的酶和一种来源于人的酶,建立了一种酶法合成、层析法分离制备UDP-GlcNAc/GalNAc及其结构类似物的方法,获得了糖核苷酸类似物,并用它们研究了来源于细菌的GlcNAc糖基转移酶的性质和细菌多糖的合成。分析糖基转移酶性质时,还建立了一种不需要标记和分离目标分子的新方法。


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