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胆固醇氧化酶的异源表达和应用研究

付娟  
【摘要】:胆固醇氧化酶是胆固醇降解过程中的关键酶,能够专一性地将胆固醇氧化为胆甾酮,在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有巨大的应用价值。胆固醇氧化酶主要来源于微生物,已发现的能够产生胆固醇氧化酶的微生物有节杆菌Arthrobacter,甾短杆菌Brevibacterium sterolicum,分枝杆菌Mycobacterium,诺卡氏菌Nocardia erythropolis,假单胞菌Pseudomonas,红球菌Rhodococcus等。本实验室已经筛选到一株能够产生胆固醇氧化酶的菌株,博德特氏菌Bordetella sp.B4,在此基础上进行了以下研究: 1.胆固醇氧化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达 克隆得到了Bordetella sp.B4中的胆固醇氧化酶基因Bcod。测序结果表明,Bcod全长1656 bp,与短杆菌(Brevibacterium sp.DGCDC-82,Brevibacterium sterolicum)、节杆菌(Athrobacter sp.F2)、马红球菌(Rhodococcus equi)中胆固醇氧化酶基因的序列同源性达到99%。将Bcod基因插入pET-22b(+)载体,转化E coli Rosetta(DE3),得到的重组菌R/Bcod在IPTG诱导下能够产生大小约为59 kDa的胆固醇氧化酶(BCOD),但是在37℃诱导产生的BCOD多以没有活性的包涵体形式存在。通过对R/Bcod的诱导条件进行优化,最终确定在诱导温度为20℃,IPTG浓度为0.025 mM的条件下诱导8h能够得到最大BCOD酶活产量,约为350 U/L 2.共表达分子伴侣提高重组E coli中活性胆固醇氧化酶的产量 将已构建好的pET-Bcod重组质粒和分子伴侣GroEL.GroES的表达载体pACYC-me共同转化入E coli BL21(DE3),得到重组菌株BL21/mc/Bcod。通过优化诱导条件,在20℃、IPTG浓度为1 mM的条件下诱导18h,BL21/mc/Bcod中活性BCOD的产量可以达到1000 U/L,比单独表达BCOD的对照重组菌BL21/Bcod的最高酶活产量(450 U/L)提高了1.2倍。用SDS-PAGE分析两株菌中包涵体蛋白产生情况,发现在BL21/mc/Bcod中包涵体蛋白大大减少。以上结果说明,BCOD与分子伴侣蛋白GroEL、GroES共表达减少了重组菌中不溶的、无活性的BCOD的产生,促进了可溶的、有活性的BCOD的产生。对BL21/mc/Bcod中的BCOD进行了纯化,纯化后的BCOD在SDS-PAGE凝胶上显示一大小约为59 kDa的单一电泳条带。对纯酶BCOD的酶学性质进行分析发现,重组BCOD的最适作用温度和pH分别为40℃和pH 7;与原菌中BCOD相比,温度稳定性和对底物胆固醇的亲和力有所下降,Ag+的抑制作用减弱,而Cu2+对BCOD有激活作用。 3.胆固醇氧化酶在乳酸乳球菌中的表达 利用乳酸乳球菌的NICE表达系统,构建了诱导表达BCOD的重组乳酸乳球菌LSc。通过单因子优化实验,确定在LSc菌体浓度为OD600=0.4时,添加终浓度为4 ng/mL的nisin,在20℃诱导8 h,BCOD产量达到340 U/L。对LSc中BCOD粗酶的酶学性质进行分析,发现其最适作用温度和pH分别为37℃和pH 7;BCOD粗酶在pH 5-10范围内非常稳定;Ag+对BCOD酶活有较强的抑制作用,Cu2+则有激活作用。 4.重组乳酸乳球菌LSc降解胆固醇的研究 对LSc在诱导条件下对培养基中添加的胆固醇的降解效果以及LSc粗酶液对鸡蛋黄中胆固醇的降解效果进行了研究。结果发现,在培养基中添加110μg/mL胆固醇时,经LSc作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为20%、47%、67%;在处理液中添加蛋黄使胆固醇浓度为1260μg/mL时,在0.5 M NaCl存在条件下,用LSc粗酶液作用24 h、48 h、72 h后,胆固醇的降解率分别为40%、70%、80%。


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