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《山东大学》 2011年
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牙鲆(Paralichtys olivaceus)性别相关基因dax1的克隆与表达分析

王丽娟  
【摘要】:性别决定和性腺分化是鱼类生殖过程的重要部分,也是保证其生存和进化的一个基本过程。dax1基因是孤儿核受体的一员,在性别决定和分化中有着重要的作用。本研究首先克隆了鲆鲽鱼-牙鲆(Paralichthys olivaceus) dax1全长cDNA及5'侧翼区序列,研究了该基因在成鱼各组织的特异表达,进一步采用实时定量PCR技术分析了该基因在早期胚胎发育以及性腺分化发育过程中的表达,并研究了该基因启动子区CpG岛的甲基化状态。同时在体外对该基因进行了原核重组表达。 首先,本研究采用RT-PCR以及RACE等方法从牙鲆腺组织中克隆出牙鲆dax1基因的全长cDNA序列(Genebank accession No. HQ380020)。分析结果表明,牙鲆dax1 cDNA序列全长1446bp,包括5'非翻译区219bp,3'非翻译区330bp,开放阅读框897 bp,编码298个氨基酸残基,理论蛋白分子量为33.08 kDa。该cDNA序列具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和Poly (A)。牙鲆Dax1的DNA结合域DBD缺乏典型的锌指结构,与其他非哺乳类动物Dax1蛋白类似,牙鲆Dax1只有一个保守的LXXLL基序,而没有NR盒1和NR盒2。序列相似性比对发现,牙鲆dax1与其他鱼类dax1相似性最高,继而是鸟类、爬行类和哺乳类。 利用基因组步移的方法,获得了牙鲆dax1转录起始位点前2Kb的基因组序列,并识别出可能的启动子序列。用MatInspector等软件对牙鲆dax15'侧翼序列的转录因子结合位点进行预测,进一步对牙鲆和其他脊椎动物的dax15'侧翼序列的保守功能模块和网络进行了分析。结果表明,牙鲆dax15'侧翼区存在sf1、wt1、TCF/LEF、oct3/4等保守的转录因子结合位点。 组织特异性表达结果显示,daxl基因在牙鲆成体大多数组织中都可以检测到,性腺、脾脏和脑表达量相对较高,而肝脏和肌肉的表达量相对较低。在两性性腺中均可以检测到该基因的表达,但是存在比较明显的两性表达差异,在卵巢中的表达强于精巢。Real-time PCR结果显示,该基因在牙鲆胚胎发育早期就可以检测到表达,但各发育阶段表达量不同。该基因在二倍体对照牙鲆、雌核发育及雌核发育性反转牙鲆性腺分化开始前(全长约2cm)表达量迅速升高,达到最大值,在性腺分化开始时表达量降低。同时,该基因在不同性腺发育时期的表达量也有差异。整体来说,dax1在牙鲆各期卵巢中的表达量都高于相应时期精巢中的表达量。其中,Ⅰ期雌雄性腺中表达量相近,Ⅱ期精巢和卵巢中表达量都有所上升,之后在Ⅲ期在精巢和卵巢都有所下降,但卵巢表达量依旧略高于精巢,到Ⅳ期表达再次上升,尤其是卵巢的表达量上升较明显,Ⅴ期表达量比Ⅳ期略有下降。 甲基化表观遗传修饰水平研究结果显示,牙鲆dax1基因调控区的14个CpG位点的甲基化水平均较低,不存在明显的两性差异。卵巢中的甲基化水平为1.4%(2/140),精巢中的甲基化水平为2.1%(3/140)。雌核发育牙鲆卵巢及雌核发育性反转牙鲆的精巢dax1基因调控区CpG位点甲基化水平也没有明显的两性差异,前者2.1%(3/140)的CpG位点发生了甲基化,后者中也仅有2.8%(4/140)的CpG位点发生了甲基化,。 将牙鲆dax1基因编码区序列插入到表达质粒pProEXTMHTa上,在大肠杆菌Transetta (DE3)中对Dax1蛋白进行体外重组表达原核表达。获得的重组蛋白存在于宿主菌中,不是分泌型蛋白,大部分的Dax1重组蛋白以包涵体形式出现。在37℃的培养条件下,重组蛋白的最佳IPTG诱导时间为4 h,最佳诱导浓度为1mmol/L。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S917.4;Q78

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