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《山东大学》 2011年
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木霉纤维素膨胀因子Swollenin与β-葡萄糖苷酶的功能研究

周庆新  
【摘要】:纤维素是自然界中数量最庞大的可再生资源,它的降解不仅构成了自然界碳循环的一个重要环节,而且为生物燃料的生产提供了一个潜在的应用空间。然而,由于木质纤维素结构特殊,由此形成的抗生物降解屏障使其转化加工过程的成本居高不下,构成了利用纤维素材料生产生物能源的最大瓶颈。 以瑞氏木霉为代表的腐生多细胞真菌,具有很强的分泌纤维素酶的能力,是研究纤维素降解的主要模式生物。在纤维素底物存在的条件下,它能够大量分泌三种协同降解纤维素的酶:内切葡聚糖酶,纤维二糖水解酶,β-葡萄糖苷酶。其中内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区,随机水解纤维素链中的糖苷键,产生大量不同聚合度的纤维素短链;外切酶(纤维二糖水解酶)可以从纤维素链的还原端(CBHⅠ)或非还原端(CBHⅡ)开始持续水解单根纤维素糖链,释放纤维二糖并由此破坏纤维素的结晶区;β-葡萄糖苷酶则主要水解纤维二糖和可溶性纤维寡糖,最终将纤维素转化为可利用的葡萄糖。与内切酶和外切酶的结构、功能的研究和分析相比,p-葡萄糖苷酶的研究较少。2008年公布的瑞氏木霉基因组序列测定结果表明,除已知的纤维素内切酶和外切酶外,还包括多达7种的β-葡萄糖苷酶。而且这些p-葡萄糖苷酶基因的转录水平存在着明显差异。尽管研究表明p-葡萄糖苷酶是纤维素降解为单糖所必须的,但是如此众多的p-葡萄糖苷酶在瑞氏木霉利用纤维素过程中的功能和作用机制还不明确。 除上述已知的纤维素酶活性组分外,包括瑞氏木霉在内的纤维素产生菌在纤维素存在的条件下往往也会产生一些无明显水解活性或活性较低的诱导表达组分。其中纤维膨胀因子(Swollenin)是一类与植物细胞壁扩展因子(Expansin)具有一定同源性,但同时具有纤维素酶典型结构域组成的非水解活性蛋白,与Expansin能疏松和破坏植物细胞壁中的多聚糖(例如纤维素和半纤维素)间的相互联接类似,Swollenin虽不水解纤维素但能够使棉纤维和滤纸发生膨胀。其精确的作用机制,尤其是其在纤维素水解过程中与纤维素酶潜在的协同作用及协同机制还需要进一步研究。 针对以上两个方面,我们建立了黑曲霉外源蛋白表达体系,在黑曲霉中表达并纯化了Swollenin,对其性质及其与纤维素酶在催化水解纤维素过程中的协同水解活性进行了初步研究;对瑞氏木霉p-葡萄糖苷酶Cel1b及其催化活性相关氨基酸的点突变体进行了表达纯化,分析了其水解活性和转糖基活性,同时构建了β-葡萄糖苷酶cel1a和cel1b基因的敲除菌株,研究了其在瑞氏木霉利用纤维素过程中对纤维素酶表达的影响。本论文主要的创新研究结果如下: 1.构建了带有多克隆位点的黑曲霉通用表达质粒,获得了拟康氏木霉Swollenin全蛋白(SWO2)及各种结构域缺失突变体蛋白的表达菌株。 为了建立Swollenin高水平表达体系,获得大量的Swollenin蛋白用于其性质研究,我们构建了以葡萄糖淀粉酶启动子glaA和构巢曲霉色氨酸合成酶基因(trpC)的终止子为控制元件,以pyrG为转化筛选标记的通用表达载体。其中在启动子的后面融合了6×His和流感血凝素(Hemagglutinin, HA)串联标签以及多克隆位点,6×HisHA有利于纯化和鉴定目的蛋白,而多克隆位点有利于插入各种要表达的目的蛋白。将SWO2全蛋白基因及各种功能结构域突变蛋白的基因片段连接到上述质粒中,得到表达质粒。利用PEG介导的原生质体转化法转化黑曲霉MGG029,经过复筛,单孢分离和Western blot检测,获得了目的蛋白表达量较高并且能够稳定表达的菌株。 2.从黑曲霉MGG029发酵液中纯化获得了Swollenin全蛋白,对重组表达的Swollenin与纤维素酶的协同作用活性进行了研究。 为了研究Swollenin的性质,我们首先建立了重组表达的SW02的纯化方法。黑曲霉重组转化子发酵液依次经过阴离子交换柱层析(Q Sepharose fast flow column)和疏水层析(TSK-gel phenyl-5PW)分离而得到纯酶组分,质谱分析鉴定确定了所纯化的组分为目的蛋白SW02。1L发酵液经过上述简单的分离步骤可以获得约10 mg的纯化目的蛋白。EndoHf处理重组Swollenin后分子量仅发生轻微的减小,表明所获得的Swollenin蛋白可能不只发生N-糖基化,其它的蛋白修饰如O-糖基化等也是重要的影响因素;与烟曲霉AfSwo1较低的CMC酶活(2.6U/mg)相比,我们纯化的Swollenin在以Avicel (PH101), CMC, RAC为底物时测得的酶活更低。在低纤维素酶使用剂量(0.08~0.09 FPU/g纤维素)的条件下,采用与Swollenin同时处理纤维素和先后处理两种方法检测协同活性,结果表明先后处理的协同活性最高可比同时处理时高出近一倍,推测可能是由于Swollenin可先对纤维素表面进行了某种修饰,从而促进了后续纤维素酶的催化水解作用。Swollenin中哪一结构域介导了纤维素表面结构的修饰变化以及此种变化的性质还有待进一步研究。 3.表达纯化了瑞氏木霉Cel1b及其催化活性相关氨基酸的点突变体,对其水解活性和转糖基活性进行了研究。 研究表明某些第一家族的p-葡萄糖苷酶具有转糖基活性,为深入研究瑞氏木霉中β-葡萄糖苷酶的功能性质,我们首先根据瑞氏木霉Cel1a的晶体结构,同源模建了瑞氏木霉Cel1b的三维结构;同时根据糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的序列比对,发现糖基绑定位点周围的残基具有很强的保守性,而糖苷配基绑定位点周围的残基保守性较低。针对糖苷配基绑定位点周围不保守的残基,设计构建了五个Cel1b的突变体。进一步表达纯化了Cel1b及其催化活性相关氨基酸的点突变体,并对其水解活性和转糖基活性进行了分析。结果表明,Cel1b在高底物浓度条件下具有很明显的转糖基活性,可以将部分葡萄糖转化为纤维二糖,将部分纤维二糖转化为纤维三糖和纤维四糖。与野生型蛋白相比,1174C和D242H突变体蛋白的比酶活有所上升,而Y178L, S442A和H265A突变体蛋白的比酶活基本不变。其中,I174C突变体蛋白的比酶活是野生型蛋白的143倍,结合其晶体结构和动力学参数分析,推测174位的异亮氨酸突变为半胱氨酸后导致催化效率提高而使酶活提高,该位点突变导致的水解活性的变化为构建高产纤维素酶以及高活性纤维素酶系统提供了一条新思路。 4.对cel1a和cel1b进行了体内同源重组敲除,研究了二者在瑞氏木霉利用纤维素过程中对纤维素酶表达的影响。 为了获得cel1a和cel1b基因的缺失菌株,我们构建了相关同源敲除盒,转化重组到瑞氏木霉基因组上后得到了cel1a和cel1b的基因敲除菌,观察其在纤维二糖平板和球磨纤维素平板上的生长情况,发现cel1a和cel1b基因敲除菌株在纤维二糖平板上的生长较野生型菌株QM9414明显受到了抑制,其中Δcel1a菌株比Δcel1b菌株生长更慢,推测可能是由于Cel1a和Cel1b作为胞内主要的p-葡萄糖苷酶,其酶活的丧失使细胞无法有效地代谢纤维二糖进行正常生长。在球磨纤维素平板上,Δcel1a菌株与Δcel1b菌株的水解圈都比野生型菌株QM9414小,其中Δcel1a菌株的水解圈最小。将野生型菌株QM9414及两种基因缺失菌株Δcel1a菌株和Δcel1b菌株分别在结晶纤维素Avicel为碳源的发酵培养基上培养,发现在诱导初期,两种基因敲除菌分泌的蛋白量明显低于野生型菌株QM9414,但随着培养时间的延长,蛋白分泌量逐渐提高。进一步分析发现,在结晶纤维素Avicel培养基中,上述两种基因缺失菌株发酵液的外切酶酶活随时间的延长而提高,但Δcel1a菌株和Δcel1b菌株的外切酶酶活明显比野生型菌株QM9414低,且与野生型菌株相比,Δcel1a菌株和Δcel1b菌株在诱导条件下发酵液的等量总蛋白中的外切酶酶活单位数较低,表明两种基因缺失菌分泌的外切酶在总蛋白中的比例比野生型要低。与野生型菌株相比,在Avicel诱导条件下,cel1acel1b基因的缺失导致主要纤维素酶基因cbhI的转录延迟,其中Δcel1a菌株中cbhI的转录延迟了9h,直到12h才有转录;Δcel1b菌株中cbhI的转录延迟了3h。以上结果与这两个基因缺失突变株在以Avicel为碳源的平板上产生水解圈的大小相一致,进一步表明cel1a和cel1b两个基因的敲除影响了纤维素酶的快速诱导表达。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q93

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