糖尿病大鼠心肌乙醛脱氢酶2（ALDH2）活性与心功能关系的研究

【摘要】：背景： 糖尿病是近年来常见的一种代谢紊乱性疾病,糖尿病急性与慢性并发症致残率和致死率极高,严重影响人们的生活质量甚至威胁人们的生命。其中,心血管并发症,如糖尿病心肌病是导致糖尿病病人死亡的主要因素之一。这种常见的心血管并发症常悄无声息的发生,主要表现为左心室收缩和/或舒张功能减低。这种心功能障碍并非由冠状动脉疾病或高血压所致,因此,命名为糖尿病心肌病。然而,引起糖尿病心肌病的分子学机制至今尚未阐明。 高血糖引起活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生增加,包括超氧阴离子(Superoxide anion, O2-)、羟自由基(Hydroxyl radicals,·OH)以及过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)。这些自由基攻击力极强,在糖尿病并发症发生发展过程中起重要作用。线粒体乙醛脱氢酶2 (Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)参与酒精代谢,主要催化乙醇代谢产物乙醛氧化为乙酸。ALDH2也催化其他醛类如4-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)氧化为无毒性的相应酸。4-HNE由活性氧脂质过氧化产生,具有高反应活性。最近研究发现心肌ALDH2在心脏缺血-再灌注损伤中具有细胞保护作用,推测这种心肌保护作用是由于ALDH2促进毒性的4-HNE氧化代谢所致。然而,以前的研究也提示在ALDH2的酶活性中心有易氧化还原的巯基基团,因而易受到氧化应激的攻击而使酶活性抑制。 研究目标： 本课题的研究目标是探讨糖尿病高血糖导致的氧化应激对心肌线粒体ALDH2活性的影响；以及高血糖状态下,ALDH2活性与左心室功能障碍之间的相关性及可能机制。 方法： 本课题采用雄性Wistar大鼠,体重200-250克。大鼠腹腔(Intraperitoneal, i.p.)注射60mg/Kg链脲左菌素(Streptozotocin, STZ)以诱发糖尿病。大鼠随即分为以下四组(每组8只大鼠)：对照组、糖尿病未治疗组、糖尿病+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)组、糖尿病+硫辛酸(α-lipoic acid,α-LA)组。糖尿病诱导一周后,NAC和a-LA分别给予糖尿病+NAC治疗组和糖尿病+α-LA治疗组,持续8周。 高分辨率显微超声仪测量大鼠舒张末期左室内径(Left ventricular end-diastolic internal diameter, LVEDD)、舒张末期室间隔厚度(Interventricular septal end-diastolic thinkness, IVSD)、舒张末期左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall end-diastolic thinkness, LVPWD)、收缩末期左室内径(Left ventricular end-systolic internal diameter, LVESD)、收缩末期室间隔厚度(interventricular septal end-systolic thinkness, IVSS)、收缩末期左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall end-systolic thinkness, LVPWS)。通过上述测量值计算左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室乳头肌短轴切面测量短轴缩短率(Left ventricular short axis fraction shortening, LVFS)等反映左心室收缩功能的指标。心肌HE染色检测心脏结构变化。 血糖浓度由血糖试纸条测定,糖化血红蛋白(HbA1c)通过高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography, HPLC)测定。血浆总抗氧化能力、心肌匀浆中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量(一种脂质过氧化的可靠指标)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量以及超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase, Mn-SOD)活性由商业化试剂盒测定。选用对过氧化物敏感的荧光探针二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)检测心肌细胞内ROS水平,通过流式细胞仪测定。提取的心肌线粒体经超声裂解获得线粒体蛋白,线粒体蛋白与ALDH2底物乙醛或丙醛反应,通过检测乙醛转变为乙酸或丙醛转变为丙酸过程中吸光度的变化来反应ALDH2的活性。为明确ALDH2活性降低是由于活性中心的巯基基团氧化损伤所致,分离糖尿病未治疗组和对照组大鼠心肌线粒体,线粒体蛋白与选择性巯基还原剂二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)体外孵育后检测ALDH2活性。Western blot检测心肌ALDH2蛋白的表达,免疫组化方法检测心肌4-HNE含量。 体外培养心肌细胞,检测ALDH2活性抑制在高糖诱导心肌线粒体膜电位(△ψm)改变中的作用。培养心肌细胞分成四组：低糖组(培养液中葡萄糖浓度5.5 mmol/L)、高糖组(培养液中葡萄糖浓度30 mmol/L)、低糖合并ALDH2选择性抑制剂daidzin组、高糖合并ALDH2选择性抑制剂daidzin组。刺激48小时后,线粒体膜电位由一种特殊荧光染料JC-1 (5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-benzamidazolocarbocyanin iodide)来检测。 结果： 大鼠注射STZ后表现出明显的糖尿病特征,包括多饮、多食、多尿,同时增重增加低于未注射STZ的对照组。实验结束时,糖尿病未治疗组大鼠血糖和HbA1c水平显著高于对照组(P0.05)。糖尿病大鼠给予NAC或α-LA治疗8周后,这些糖尿病特征性表现均明显改善。糖尿病未治疗组大鼠体重显著体重低于正常对照组(P0.05)。糖尿病+NAC治疗组大鼠体重高于糖尿病未治疗组,但两组大鼠体重尚未达到统计学差异(P0.05)。α-LA对糖尿病大鼠体重无明显影响。糖尿病未治疗组组大鼠心肌MDA和ROS含量均显著高于对照组大鼠(P0.05)；糖尿病未治疗组心肌GSH含量和Mn-SOD活性显著低于对照组(P0.05)。糖尿病大鼠给予NAC或α-LA治疗能明显改善这些变化(P0.05)。 HE染色的结果显示与对照组相比,糖尿病未治疗组大鼠心肌明显肥大,糖尿病大鼠给予NAC或α-LA治疗组,心肌细胞肥大有所改善。糖尿病未治疗组大鼠左心室EF和FS显著低于对照组(P0.05)。糖尿病+NAC或α-LA治疗组EF和FS较糖尿病未治疗组显著提高(P0.05)。糖尿病大鼠心肌线粒体ALDH2活性显著低于对照组(P0.05)。相对于对照组,糖尿病组心肌ALDH2活性约下降40%(以丙醛为底物)。糖尿病+NAC或α-LA治疗能显著提高心肌线粒体ALDH2活性(P0.05),但两治疗组ALDH2活性仍低于对照组(P0.05)。心肌ALDH2活性与心脏EF和FS之间存在正相关性(EF：r2=0.680,P0.01；FS：r2=0.733,P0.01)。 分离糖尿病未治疗组和对照组大鼠心肌线粒体,线粒体蛋白与DTT在体外孵育30分钟。0.5mmol/L DTT不能显著提高糖尿病未治疗组和对照组大鼠心肌ALDH2的活性(P0.05),但1或2mmol/L DTT能显著提高糖尿病未治疗组和对照组大鼠心肌ALDH2的活性(P0.05)。Western blot结果显示糖尿病未治疗组大鼠心肌ALDH2表达显著低于对照组(P0.05),同时糖尿病未治疗组心肌4-HNE含量显著增加(P0.05)。糖尿病+NAC或α-LA治疗组心肌ALDH2表达显著增加(P0.05),4-HNE含量降低(P0.05)。 新生鼠心肌细胞给予高糖刺激后线粒体膜电位(△Ψm)明显下降(P0.05),低糖组中给予ALDH2活性抑制剂daidzin后对线粒体膜电位(△Ψm)无明显影响。与高糖刺激组相比较,高糖合并ALDH2抑制剂daidzin组心肌细胞线粒体膜电位(△Ψm)显著降低(P0.05),提示高糖状态下ALDH2活性抑制可进一步加剧线粒体损伤。 结论： 糖尿病大鼠高血糖状态下增多的自由基直接攻击心肌线粒体ALDH2导致酶活性可逆性和不可逆性抑制,氧化应激还能抑制心肌ALDH2蛋白的表达,抗氧化治疗能改善这些变化。心肌ALDH2活性与左心室功能存在正相关性,体外实验显示高糖合并ALDH2活性抑制可进一步加重线粒体损伤,ALDH2活性抑制导致线粒体功能障碍将为高糖导致心功能障碍提供分子学机制。

【关键词】：乙醛脱氢酶2 心功能障碍 糖尿病 活性氧
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R587.1;R542.2
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