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《山东大学》 2011年
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有氧运动对动脉粥样硬化斑块易损性及基质金属蛋白酶,IL-6水平的影响

张栩  
【摘要】:背景 颈动脉粥样硬化是引起缺血性脑血管病的重要原因,颈动脉闭塞、粥样斑块或血栓的脱落均可引起脑梗死。颈动脉粥样硬化斑块的稳定性与脑梗死密切相关。易损斑块的特点是脂质核心较大,纤维帽薄,炎性细胞丰富。易损斑块破裂及血栓形成的危险高。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是与动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)发生、发展过程关系密切的一类蛋白水解酶。MMPs是降解细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)最重要的酶类。越来越多的证据表明,MMPs通过降解AS斑块的纤维帽,诱发斑块破裂,导致血栓形成或栓塞。运动对AS的防治有非常积极的作用,运动可降低动脉粥样硬化导致的心脑血管病的死亡率。以往关于运动抗AS的机制研究多集中在运动对脂代谢,血管内皮功能,以及运动的抗氧化功能,影响血管收缩舒张功能影响上近年来的研究认为,适当的运动能显著改善机体抗炎症的能力。这可能是运动可以有效防治AS的新机制。但运动对动脉粥样硬化斑块易损性的影响未见报导。本研究以ApoE基因缺陷小鼠建立AS动物模型,通过颈动脉套管的方法建立颈动脉狭窄及易损斑块模型,观察有氧运动对颈动脉粥样硬化斑块形成的影响。并通过动脉粥样硬化斑块病理学检测,易损指数测定以及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14)的表达,探讨运动对AS的影响机制。 目的 1.观察有氧运动对动脉粥样硬化斑块易损性的影响。 2.观察有氧运动对动脉粥样硬化斑块内MMP-9、MMP-14水平变化的影响。 方法 1.颈动脉易损斑块动物模型的构建 通过颈动脉套管构建AS易损斑块动物模型。96只10周龄雄性ApoE基因缺陷小鼠随机分为有氧运动组(n=48)及对照组(n=48),均给予高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)。给予实验动物施行右颈总动脉套管术以诱发AS病变。造模成功4周后,运动组以坡度为0%,15米/分的速度在国产电动鼠类跑台上进行跑步训练。每天运动30分钟,每周运动6天,周日休息,共运动8周。对照组采取限制应激刺激。手术4周后,将小鼠放在能够限制其活动的笼子中,每次1小时,每天1次,持续8周。 2.造模成功12周后,测量两组小鼠血脂水平 3.观察有氧运动与动脉粥样硬化斑块形态结构,易损指数及MMP-9、MMP-14表达的关系 3.1病理学检测:对颈动脉斑块进行HE染色以观察斑块的形态结构。测量斑块面积和纤维帽的厚度,计算斑块的破裂率。对颈动脉斑块进行油红0染色以检测斑块内脂质含量。对颈动脉斑块进行天狼猩红染色以检测斑块内胶原含量。并通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、MMP-9及MMP-14的蛋白水平。检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的含量。计算易损指数:易损指数=(巨噬细胞+脂质)阳性面积百分比/(平滑肌细胞十胶原)阳性面积百分比。 3.2 RT-PCR检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取RNA, RT-PCR检测MMP-9和MMP-14mRNA的表达量。 3.3 Western blot检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取蛋白质,Western blot检测斑块内MMP-9和HMP-14蛋白质水平。 结果 1.有氧运动组和对照组在实验开始的体重比较差异无统计学意义(P0.05)。实验末期(处死取材前)的体重比较差异无统计学意义(P0.05) 2.血液生化指标检测:有氧运动组及对照组血清TC,TG,HDL-C,LDL-C水平差异无统计学意义(P0.05)。 3.有氧运动对颈动脉粥样硬化斑块的影响 3.1病理学检测:有氧运动组和对照组比较,斑块面积差异无统计学意义(斑块面积分别为81000±9000um2和82000±12000um2,P0.05)。有氧运动组胶原含量明显增加(分别为16.44%±4.73%和11.33%±3.58%,P0.05)。脂质含量明显减少(分别为12.54%±2.11%和21.23%±3.46%,P0.05)。纤维帽厚度明显增加(分别为7.35±1.25um和6.63±0.97um,P0.05)。帽/核比值明显增加(分别为0.09±0.01和0.06±0.01,P0.05)。有氧运动组斑块中有5个纤维帽中断,5个斑块内埋藏的纤维帽,未见血栓和出血现象。斑块破裂率为20.8%。对照组斑块中有4个斑块破裂并血栓形成,4个斑块内出血,6个斑块内埋藏的纤维帽,10个纤维帽中断。斑块破裂率为50%。两组比较差异有统计学意义(P0.05)。有氧运动组易损指数明显降低(分别为0.80±0.53和2.84±1.12,P0.05)。 3.2免疫组化染色 有氧运动组和对照组比较,巨噬细胞明显减少(分别为7.57%±2.67%和15.42%±3.11%,P0.05)。α-SMC-actin明显增加(分别为12.97%±1.91%和5.87%±1.19%,P0.05)。MMP-9明显减少(分别为4.19%±0.32%和9.89%±0.88%,P0.05)。MMP-14明显减少(分别为6.69%±0.56%和12.42%±1.54%,P0.05)。差异有统计学意义。 3.3 RT-PCR检测 与对照组相比,有氧运动组颈动脉斑块组织中MMP-9mRNA的表达量降低68.4%,两组间差异有统计学意义(P0.05)。MMP-14 mRNA的表达量降低78.3%,两组间差异有统计学意义P0.05)。 3.4免疫印迹检测 与对照组相比,有氧运动组颈动脉斑块组织中MMP-9蛋白的表达量降低62.8%(P0.05)。MMP-14蛋白的表达量降低55.1%(P0.05)。两组间差异均有统计学意义。结论 1.有氧运动增加颈动脉粥样硬化斑块纤维帽厚度,增加帽核比,降低斑块破裂率。有氧运动降低斑块内巨噬细胞和脂质的含量,增加斑块内平滑肌细胞及胶原的表达,降低斑块易损指数。有氧运动能减少颈动脉粥样硬化斑块的易损性。 2.有氧运动降低ApoE基因缺陷小鼠颈动脉粥样硬化斑块内MMP-9,MMP-14mRNA及蛋白表达 有氧运动对载脂蛋白E基因缺陷小鼠颈动脉粥样硬化的抗炎性影响背景 颈动脉粥样硬化是缺血性脑血管病的重要病理学基础。动脉粥样硬化(Aterosclerosis, AS)是一个慢性炎症过程。炎症反应是导致动脉粥样硬化发生和发展过程中的一个极为重要的因素。大量研究证明C反应蛋白(C-reactive protein, CRP),白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)等炎症因子水平增高与AS的发生发展密切相关。CRP是典型的炎症反应刺激物,在创伤和感染等应激反应时升高。近年研究认为,CRP是心血管缺血事件的独立预测因子。炎性细胞分泌的细胞因子如IL-6、IL-8等可导致内皮细胞的活化,平滑肌细胞的增生凋亡及AS病变的进展。炎症因子可促进纤维帽的降解,使胶原成分减少,斑块易于破裂。动脉粥样硬化(AS)是一种多因素疾病。转基因动物载脂蛋白E (ApoE)基因缺陷小鼠是研究AS的较好的动物模型。已有研究证实,有氧运动能减少斑块面积,延缓AS形成,是防治动脉粥样硬化及其并发症的有效措施。本研究通过观察有氧运动对小鼠颈动脉粥样硬化斑块形态结构的作用,及运动对1L-6水平的影响,揭示运动抗动脉粥样硬化的机制。 目的 1.观察有氧运动对颈动脉粥样硬化斑块病理形态的影响。 2.观察有氧运动对颈动脉粥样硬化斑块内IL-6水平变化的影响。方法 1.颈动脉粥样硬化动物模型的构建 通过颈动脉套管方法构建颈动脉粥样硬化动物模型。80只10周龄雄性ApoE基因缺陷小鼠随机分为有氧运动组(n=40)及对照组(n=40),均给予高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)。给予实验动物施行右颈总动脉套管术以诱发AS病变。造模成功4周后,运动组以坡度为0%,15米/分的速度在国产电动鼠类跑台上进行跑步训练。每天运动30分钟,每周运动6天,周日休息,共运动12周。对照组采取限制活动,手术4周后,将小鼠放在能够限制其活动的笼子中,每次1小时,每天1次,持续12周。 2.造模成功16周后,测量两组小鼠血脂水平及血清IL-6水平 3.观察有氧运动与动脉粥样硬化斑块形态结构及斑块内IL-6表达的关系 3.1病理学检测:对颈动脉斑块进行HE染色以观察斑块的形态结构。测量斑块面积和纤维帽的厚度。对颈动脉斑块进行油红0染色以检测斑块内脂质含量。对颈动脉斑块进行天狼猩红染色以检测斑块内胶原含量。并通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)、IL-6的蛋白水平。检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的含量。 3.2 RT-PCR检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取RNA, RT-PCR检测IL-6mRNA的表达量。 3.3 Western blot检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取蛋白质,Western blot检测斑块内IL-6蛋白质水平。 结果 1.有氧运动组和对照组在实验开始的体重比较差异无统计学意义(P0.05),实验末期(处死取材前)的体重比较差异无统计学意义(P0.05) 2.血液生化指标检测 2.1两组血清TC,TG,HDL-C,LDL-C水平差异有统计学意义(P0.05)。有氧运动组和对照组比较,TC(分别为14.13±2.86mmol/L和16.37±3.21mmol/L,P0.05)。TG(分别为0.39±0.11mmol/L和0.71±0.12mmol/L,P0.05)。HDL-C(分别为3.42±0.24 mmol/L和1.44±0.26mmol/L,P0.05)。LDL-C(分别为7.01±1.02mmol/L和5.13±1.17 mmol/L,P0.05) 2.2 IL-6水平:有氧运动组组和对照组的血清IL-6水平有统计学差异。(分别为61.27±9.64 pg/ml和182.38±10.89 pg/ml,P0.05) 3.有氧运动对颈动脉粥样硬化斑块的影响 3.1病理学检测:有氧运动组和对照组比较,斑块面积差异有统计学意义(斑块面积分别为75000±10050μm2和83000±11000um2,P0.05),有氧运动组胶原含量明显增加(分别为16.34±4.72%和11.04±3.52,P0.05),脂质含量明显减少(分别为12.35±2.11%和21.33±3.66%,P0.05),纤维帽厚度明显增加(分别为7.35±1.45um和6.53±0.86um,P0.05),帽/核比值明显增加(分别为0.09±0.02和0.05±0.01,P0.05)。 3.2免疫组化染色 有氧运动组和对照组比较,巨噬细胞明显减少(分别为8.67%±2.57%和16.43%±3.12%,P0.05),α-SMC-actin明显增加(分别为13.67%±1.71%和5.57%±1.29%,P0.05),IL-6明显减少(分别为3.59%±0.43%和9.88%±0.53%,P0.05),差异有统计学意义。 3.3 RT-PCR检测 与对照组相比,有氧运动组颈动脉斑块组织中IL-6mRNA的表达量降低59.2%,两组间差异有统计学意义(P0.05)。 3.4免疫印迹检测 与对照组相比,有氧运动组颈动脉斑块组织中IL-6蛋白的表达量降低63.9%(P0.05),两组间差异均有统计学意义。 结论 1.有氧运动增加颈动脉粥样硬化斑块纤维帽厚度,增加帽核比。有氧运动降低斑块内巨噬细胞和脂质的含量,增加斑块内平滑肌细胞及胶原的表达。有氧运动能减轻颈动脉粥样硬化程度。 2.有氧运动降低ApoE基因缺陷小鼠血清及颈动脉粥样硬化斑块内IL-6mRNA及蛋白表达
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R543.5

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