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《山东大学》 2012年
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不同类型细胞标记物在胶质瘤中的表达和作用研究

闫涛  
【摘要】:研究背景 胶质瘤,特别是胶质母细胞瘤,是成年人发病率和致死率最高的颅内恶性瘤。尽管基因分子水平的研究越来越深入,但是该肿瘤的细胞起源仍然争议较大。关于肿瘤的细胞起源和分子病理的深入研究,对该肿瘤的新靶点治疗的发现至关重要。 关于肿瘤的起源及发展,学者们提出各种假设学说,最具影响力的是克隆演变模型和肿瘤干细胞模型。克隆演变模型中,在癌细胞分裂增殖产生子代细胞过程中,不断产生新的突变,周围环境对新产生的不同突变类型的肿瘤细胞具有选择作用,能够抵御凋亡或增加侵袭的细胞容易生存下来,各种放化疗治疗后耐受性强的细胞生存下来;这个模型可以解释肿瘤内部各种细胞的异质性,包含各种克隆类型的细胞。肿瘤干细胞模型中,肿瘤细胞具有等级层次,只有一小部分细胞即肿瘤干细胞具有增殖能力维持肿瘤的生长,在肿瘤生长过程中,肿瘤干细胞可以分化为各种细胞克隆构成肿瘤异质性;对于肿瘤干细胞的靶向治疗理论上能够治愈肿瘤。 长久以来,胶质瘤通常被认为起源于脑间质中的胶质细胞;近年来,多篇文献报道胶质瘤中表达神经元标记物,某些胶质母细胞瘤细胞含有神经元特异性的离子通道,甚至产生类似神经元的动作电位。神经元标记物是一类正常条件下表达于神经元细胞的参与神经元功能的蛋白标记物,不存在于胶质细胞中;胶质瘤中神经元标记物的表达,说明胶质瘤细胞可能来源于可分化为神经元的神经干细胞,在致瘤过程中形成神经元的不完全分化;也可能来源于胶质细胞的肿瘤在恶性演变过程中,多向分化。随着神经元性胶质瘤的病例报道越来越多,科学工作者对胶质瘤中的神经元成分的研究逐渐深入,2007年世界卫生组织将“带有神经元岛样成分的胶质神经元性肿瘤”归类为多形性成胶质细胞瘤的一个亚型,专家们认为此亚型是否能成为一种变异肿瘤或者特定类型,还需要更多病例的基因分析和随访。有文献报道胶质瘤中神经元标志物β微管蛋白Ⅲ型的表达与肿瘤的低分化程度相关;而又有文献报道说胶质母细胞瘤中基因分析显示表达神经元性分化的肿瘤类型的病人生存期延长,至今,胶质瘤中神经元标记物的作用和预后争议较大。 长期以来CD133被认为是脑肿瘤干细胞的标记物,只有表达CD133的肿瘤干细胞具有致瘤性;但是,近年来越来越多的数据显示CD133阴性肿瘤细胞也具有致瘤性;这些研究既质疑CD133作为肿瘤干细胞标记物的使用正确性,也质疑了肿瘤干细胞理论。鉴于恶性脑肿瘤经常包括显著的细胞异质性,除了胶质细胞标记物及CD133外,胶质瘤细胞还表达中枢神经细胞内的多种细胞类型的标记物,比如神经元标记物。因此,脑肿瘤可能包括表达多种标记物具有不同功能特性的多种细胞群。我们运用一种携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体,这种载体中,绿色荧光蛋白位于各种细胞标记物启动子之后,此病毒载体转染肿瘤细胞后,通过绿色荧光蛋白的表达选择性分离表达特定标记物的肿瘤细胞;我们利用此类载体,可以探索表达神经干细胞标记物(巢蛋白)、神经胶质细胞标记物(神经胶质酸性蛋白)和神经元细胞标记物(神经元特异性烯醇化酶)的胶质瘤细胞的生物学特性区别。 目的 本课题我们探索胶质瘤中神经元标记物β微管蛋白Ⅲ型、神经丝蛋白、微管相关蛋白2和神经元特异性烯醇化酶的表达情况及其在不同的培养环境中的调控作用;调查神经元特异性烯醇化酶对胶质瘤的生物学特性影响以及其介导的肿瘤对乏氧、放疗和化疗耐受性的情况,并探索其表达量与胶质瘤病人预后的关系;最后,我们在CD133阴性的胶质瘤细胞群中,比较表达神经干细胞标记物(巢蛋白)、神经胶质细胞标记物(神经胶质酸性蛋白)和神经元细胞标记物(神经元特异性烯醇化酶)的胶质瘤细胞的生物学特性区别,包括细胞增殖和体内致瘤性差别。 方法 1、利用细胞免疫组化和Western blot探索神经元标记物β微管蛋白Ⅲ型、神经丝蛋白、微管相关蛋白2和神经元特异性烯醇化酶在人胶质母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤病人标本中的表达情况;细胞免疫组化检测胶质母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤病人标本细胞巢蛋白和神经胶质酸性蛋白表达情况及加入BrdUrd后表达不同标记物的U251的增殖情况。 2、利用实时定量PCR检测胶质母细胞瘤细胞中上述神经元标记物在不同培养环境(神经干细胞培养基,不含胎牛血清的饥饿培养基,乏氧环境)中的表达调控情况,并进行统计学分析。 3、利用小RNA干扰技术沉默胶质母细胞瘤细胞系中的神经元特异性烯醇化酶的表达后,用ECIS检测肿瘤细胞生长情况及移动能力,利用MTS方法检测沉默此基因后肿瘤细胞对乏氧环境、放疗和替莫唑胺敏感性的影响,并进行统计学分析。 4、利用免疫组化检测胶质瘤病人肿瘤标本中神经元特异性烯醇化酶表达情况,并利用形态测定软件对病人标本的免疫染色进行评分;获取相关病人的临床资料后,我们根据病人的免疫染色评分,将病人分为两组(高表达组和低表达组),进行生存分析。 5、利用各种类型细胞标记物的启动子后表达绿色荧光蛋白的载体质粒制作慢病毒,感染胶质瘤细胞后,利用流式细胞仪分析CD133及绿色荧光蛋白表达的阳性百分比,分选CD133阴性细胞中的表达各种标记物的细胞亚群,分析表达不同细胞类型标记物的U373在不同的培养环境中的细胞周期分布。 6、动物实验验证CD133阴性的胶质瘤细胞中表达各种类型细胞标记物的肿瘤细胞在动物中的致瘤性差别。结果 1、细胞免疫组化和Western blot结果显示胶质母细胞瘤细胞系和病人标本中表达神经元标记物β微管蛋白Ⅲ型、微管相关蛋白2和神经元特异性烯醇化酶,但是未检出到神经丝蛋白70;细胞免疫组化显示胶质瘤细胞表达神经干细胞标记物巢蛋白和神经胶质细胞标记物神经胶质酸性蛋白。 2、实时定量PCR结果显示胶质母细胞瘤细胞在不同的培养环境中神经元标记物的表达水平有改变,神经元特异性烯醇化酶在所有恶劣环境中(不含胎牛血清的培养基和乏氧)的表达升高;微管相关蛋白2在不含胎牛血清的培养基中表达显著增高,但是在乏氧环境中表达显著降低;β微管蛋白Ⅲ型的表达在乏氧环境中明显降低,在其他培养环境中未见有规律的变化。 3、沉默神经元特异性烯醇化酶的表达,使A172的移动能力显著减低,显著增加A172和U251对乏氧、放疗和替莫唑胺的敏感性。 4、免疫组化显示所有的胶质瘤病人标本都表达神经元特异性烯醇化酶,其表达量在不同的肿瘤切片中差异较大,在肿瘤坏死区域周围的假性栅栏细胞中神经元特异性烯醇化酶的表达显著增高。生存分析发现神经元特异性烯醇化酶高表达的胶质瘤病人的生存期明显短于低表达的病人;去除低级别的胶质瘤病人后,神经元特异性烯醇化酶高表达的胶质母细胞瘤病人的生存期显著短于低表达的病人。 5、通过对比U373在含胎牛血清的DMEM培养基和干细胞培养基培养后的细胞周期分析结果,我们发现表达不同标记物的所有细胞亚群都含有各个周期的细胞;在U251中通过BrdUrd实验发现表达不同标记物的所有细胞亚群都具有增值生长能力。 6、动物实验显示表达不同类型细胞标记物(Nestin, GFAP和NSE)的肿瘤细胞亚群都能在体内产生肿瘤,不同细胞亚群组间的致瘤百分比和动物生存时间未见显著性差异、 结论 1、胶质母细胞瘤细胞系和病人标本中表达神经元标记物(β微管蛋白Ⅲ型、微管相关蛋白2和神经元特异性烯醇化酶)、神经干细胞标记物(巢蛋白)和神经胶质细胞标记物(神经胶质酸性蛋白),其表达量随着周围环境的改变而改变。 2、神经元特异性烯醇化酶的表达在各种恶劣环境中增高;在胶质母细胞瘤细胞中沉默其表达后,肿瘤细胞的移动能力显著降低,对乏氧环境、放疗和化疗的敏感性显著升高。 3、神经元特异性烯醇化酶表达在各级别胶质瘤标本切片中,其表达在缺血坏死区周围的假性栅栏细胞中显著增高。神经元特异性烯醇化酶高表达的胶质瘤或者胶质母细胞瘤患者的生存期显著短于低表达者。 4、表达不同类型细胞标记物的胶质瘤细胞亚群在体外都具有增殖能力,在体内都具有致瘤性,不同细胞亚群组间致瘤百分比和动物生存时间未见显著性差异。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R739.41

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