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《山东大学》 2012年
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高血糖致认知功能障碍信号通路及阿司匹林、丹参素干预作用的研究

王天  
【摘要】:研究目的: 糖尿病已成为威胁人类健康之重要的慢性非传染性疾病。目前全世界有糖尿病人2.5亿,每年约有600万新发病患者。糖尿病可导致高血压、肾衰、失明、自主神经和外周神经病变、心血管及脑血管病变。近年的研究表明:认知功能障碍也是糖尿病的慢性并发症之一。糖尿病致认知功能障碍主要表现为:学习能力下降、记忆功能减退、理解和判断能力降低,伴有神情淡漠、表情呆滞、反应迟钝等症状。 部分研究表明,糖尿病所致认知功能障碍与中枢神经组织糖代谢紊乱、氧化应激、炎症等病理过程有关。然而,糖尿病导致认知功能障碍的机制迄今尚未完全明确!此外,糖尿病合并认知功能障碍亦无理想的治疗药物。 阿司匹林应用已超过百年。目前,阿司匹林仍被广泛用于解热、镇痛、抗风湿及抗血栓等的治疗。临床研究表明:阿司匹林能够减轻老年人认知功能障碍。糖尿病患者与非糖尿病人的生理状态不同,那么,阿司匹林对糖尿病所导致的认知功能障碍会有怎样的作用?糖尿病患者血液处于高凝状态,阿司匹林常用于预防糖尿病患者血栓形成。因此,阐明阿司匹林是否能够减轻糖尿病所致认知功能障碍具有重大临床价值。 丹参素是中药唇形科植物丹参的主要水溶性成分,为增加丹参素水溶性其常被制备成为丹参素的钠盐。在中国、韩国、日本及其他一些亚洲国家,丹参广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。但丹参素是否能够减轻糖尿病所致认知功能障碍尚未见报道。 研究方法: 本研究分为两部分。第一部分研究阿司匹林减轻高血糖致小鼠认知功能障碍作用及其机制。第二部分研究高血糖致小鼠认知功能障碍信号通路及丹参素干预作用。 1.阿司匹林减轻高血糖致小鼠认知功能障碍作用及机制的研究 C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素(150mg/kg,溶于0.1M、pH4.5的柠檬酸盐溶液)制备高血糖动物模型。3d后检测小鼠空腹血糖,血糖值高于20mmol/L小鼠继续用于实验。小鼠灌胃给予阿司匹林(30mg/kg),给药时间分别为1W、4W或8W。末次给药12h后运用水迷宫方法检测小鼠逃避潜伏期、游泳速度、游泳总路程及目标象限停留时间;水迷宫实验结束后检测小鼠体重和空腹血糖,小鼠眼内眦静脉取血,检测血清胰岛素水平;取小鼠海马组织,匀浆后运用比色法检测海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性;运用ELISA方法检测小鼠海马组织白介素-1p(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-a)含量。 2.高血糖致认知功能功能障碍信号通路及丹参素干预作用的研究 2.1.糖基化终末产物(AGEs)对海马神经细胞损伤及丹参素干预作用的研究 2.1.1.AGEs对海马神经细胞损伤作用的研究 原代培养新生C57BL/6小鼠海马神经细胞,加入不同浓度AGEs(0、25、50、100、200或400μg/ml),培养48h后吸取培养基检测乳酸脱氢酶(LDH)含量,MTT法检测AGEs对海马神经细胞生存率的影响。 2.1.2.丹参素对AGEs致海马神经细胞损伤干预作用的研究 培养新生C57BL/6小鼠海马神经细胞,加入AGEs(100gg/ml),同时加入不同浓度丹参素钠(0.1、1或10μM),培养48h后吸取培养基检测LDH、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)及TNF-α含量,运用MTT法、NeuN免疫组织化学方法观察丹参素对AGEs所致海马神经细胞损伤的影响。 2.2.丹参素对高血糖小鼠认知功能障碍作用的研究 C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素(200mg/kg,溶于0.1M、pH4.5的柠檬酸盐溶液)制备高血糖动物模型。3d后检测小鼠空腹血糖,血糖值高于20mmol/L小鼠继续用于实验。糖尿病小鼠按血糖值分为4组:糖尿病组,丹参素钠(15mg/kg)组,丹参素钠(30mg/kg)组和丹参素钠(60mg/kg)组。选取血糖正常的同龄小鼠为对照。丹参素钠组小鼠灌胃给予相应剂量丹参素钠(15、30或60mg/kg),1次/d,共给药12W。末次给药12h后运用水迷宫方法检测小鼠逃避潜伏期、游泳速度、游泳总路程及目标象限停留时间;水迷宫实验结束后检测小鼠体重和空腹血糖:小鼠眼内眦静脉取血,检测血清胰岛素水平和糖基化血红蛋白含量。 2.3.丹参素透过血脑屏障的研究 2.3.1.丹参素透过正常大鼠血脑屏障的研究 Sprague-Dawley大鼠随机分为2组:对照组和维拉帕米组,每组24只,对照组和维拉帕米组再次分为尾静脉注射丹参素钠15min、30min、60min3个亚组,每组8只。对照组大鼠腹腔注射生理盐水,90min后尾静脉注射丹参素钠(15mg/kg);维拉帕米组大鼠腹腔注射维拉帕米(20mg/k),90mmin后尾静脉注射丹参素钠(15mg/kg)。给予丹参素钠15min、30min、60min后水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠,取血及脑组织运用LC-ESI-MS/MS检测血浆及脑组织丹参素含量,计算脑组织与血浆丹参素含量比值。 2.3.2.丹参素透过脑缺血大鼠血脑屏障的研究 Sprague-Dawley大鼠随机分成3组:假手术组、脑缺血再灌注组和丹参素钠组,每组27只。在进行脑缺血再灌注手术前,每组取3只大鼠做为对照,其余大鼠随机分为3组:假手术组、脑缺血再灌注组和丹参素钠组。各组大鼠再次分为尾静脉注射丹参素钠15min、30min、60min3个亚组,每组8只。假手术组和丹参素钠组大鼠在脑缺血再灌注后立即尾静脉注射丹参素(15mg/kg);脑缺血再灌注组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。给予丹参素钠15min、30min、60min后大鼠腹腔注射水合氯醛(300mg/kg),取血、缺血侧和非缺血侧脑组织运用LC-ESI-MS/MS方法检测血浆和脑组织内丹参素含量,计算脑组织与血浆丹参素含量比值。每组随机取2只大鼠脑组织运用Western blot方法检测P-gp表达水平。 2.4.高血糖致小鼠认知功能障碍信号通路及丹参素干预作用的研究 2.4.1.丹参素对AGEs致海马神经细胞损伤保护作用机制的研究 培养新生小鼠海马神经细胞,细胞培养第10d,除对照组外其余各组分别加入AGEs(100μg/mL),同时加入不同浓度丹参素钠(0.1、1或10μM),每组8个复孔,培养48h后吸取培养基检测NO、PGE2及TNF-α。 2.4.2.丹参素减轻高血糖致小鼠认知功能障碍信号通路的研究 取小鼠海马组织,匀浆后运用比色法检测海马组织AChE活性;运用ELISA方法检测小鼠海马组织AGEs、TNF-α、白介素-6(IL-6)、PGE2及总蛋白含量;运用Western blot方法检测海马组织AGEs受体(RAGE)、p38、phospho-p38(p-p38)、p65(NF-κB)和环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达。 结果: 1.阿司匹林对高血糖致小鼠认知功能障碍的作用及其机制 与糖尿病模型组比较,给予糖尿病小鼠阿司匹林4W或8W后其逃避潜伏期缩短,给予糖尿病小鼠阿司匹林1W其逃避潜伏期未见明显变化;给予糖尿病小鼠阿司匹林4W或8W后其在目标象限停留时间延长,给予糖尿病小鼠阿司匹林1W其在目标象限停留时间未见明显改变。与糖尿病模型组小鼠相比,阿司匹林各组小鼠体重、胰岛素、血糖、游泳速度、游泳距离无显著变化;与糖尿病模型组小鼠比较,给予糖尿病小鼠阿司匹林4W或8W后其海马组织AChE活性、IL-1β和TNF-α水平明显降低。 2. AGEs对海马神经细胞损伤及丹参素干预作用 与对照组比较,AGEs能够使新生小鼠海马神经细胞生存率降低,细胞培养液内LDH含量增高。与AGEs组相比,丹参素可显著提高新生小鼠海马神经细胞生存率、降低细胞培养液内LDH含量、增加NeuN阳性细胞数量。 3.丹参素对高血糖致小鼠认知功能障碍的影响 与糖尿病模型组比较,丹参素钠组小鼠逃避潜伏期缩短且在目标象限停留时间延长。与糖尿病模型组相比,丹参素钠组小鼠体重、胰岛素、血糖、游泳速度、游泳距离及糖基化血红蛋白水平无显著变化。 4.丹参素透过血脑屏障的研究 对照组大鼠尾静脉注射丹参素钠15mmin、30min、60min后其脑组织丹参素含量分别为:53.7±8.5,24.1±5.4及19.3±4.5ng/mL。与对照组相比,维拉帕米组大鼠脑组织丹参素含量显著增高。 假手术组大鼠尾静脉注射丹参素钠15min、30min、60min后其脑组织丹参素含量分别为:57.3+9.1,25.8±5.3及19.9±6.1ng/mL。与假手术组比较,丹参素钠组大鼠缺血侧脑组织丹参素含量明显增高,而未缺血侧脑组织丹参素含量未见明显改变。 与假手术组比较,脑缺血再灌注组及丹参素钠组大鼠缺血侧脑组织P-gp表达明显降低;与脑缺血再灌注组相比,尾静脉注射丹参素钠60min后大鼠缺血侧脑组织P-gp表达降低。 5.丹参素减轻高血糖致小鼠认知功能障碍信号通路的研究 体外实验结果显示:与对照组比较,AGEs组细胞培养液内TNF-α、PGE2及NO含量增加,丹参素可明显降低细胞培养液内TNF-α、PGE2及NO含量。 体内实验结果表明:与糖尿病模型组相比,丹参素钠组小鼠海马组织内AGEs水平无显著变化;丹参素对糖尿病小鼠海马组织AChE活性未见明显影响;丹参素钠组小鼠海马组织RAGE表达水平、p38磷酸化水平、NF-κB活化水平、COX-2表达水平、TNF-α、PGE2及IL-6含量降低。 结论: 1.长期应用阿司匹林能够减轻高血糖所致认知功能障碍,其机制与血糖及胰岛素水平无关,而与阿司匹林抑制糖尿病小鼠中枢神经组织炎症细胞因子生成及降低AChE活性有关。 2. AGEs可导致海马神经细胞损伤;丹参素对AGEs致海马神经细胞损伤具有保护作用;丹参素能够减轻高血糖所致认知功能障碍。 3.丹参素可以透过血脑屏障,丹参素透过血脑屏障的量与P-gp功能及表达水平有关。 4. AGEs致海马神经细胞损伤机制与其诱导海马神经细胞炎症反应有关;高血糖致小鼠认知功能障碍与AGEs所引起的炎症反应信号通路有关。 5.丹参素减轻AGEs致海马神经细胞损伤作用及高血糖所致认知功能障碍的机制与其抑制AGEs诱导的炎症反应有关。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R587.1

【参考文献】
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