2型糖尿病发病过程中外周血循环microRNA的临床意义

【摘要】：研究背景 糖尿病前期(pre-diabetes)是指一种异常的血糖状态,特征为糖耐量减低(impaired glucose tolerance, IGT)和／或空腹血糖受损(impaired fasting glucose, IFG);因为糖尿病前期发病率极高,发展为显性2型糖尿病(type2diabetes, T2D)的风险远高于健康者,而在此期进行干预措施(包括生活方式干预和药物干预)又可以有效延缓甚至逆转进展至显性糖尿病的进程,因此糖尿病前期在糖尿病防治中具有重要意义。 糖尿病前期是从糖尿病易感者到显性T2D的病理发展过程。T2D相关基因表达异常逐步累积,最终引起某些关键的病理生理学改变,从而使病程进展从“可逆”转变为“不可逆”。如何判断糖尿病前期患者的病程是否仍然可逆,不仅有助于深入理解糖尿病前期的分子生物学基础,更具有重要的临床意义。对于累积的相关基因表达异常是否已经发展到“临界点”,仅凭空腹血糖(Fasting plasma glucose, FPG)或者2小时血浆葡萄糖(plasma glucose, PG)等外在表型来间接判断并不可靠,理想的方法应该是基于相关基因表达改变的直接判断。 MicroRNAs (miRNAs)是一组内源性、功能性的非编码小RNA片段,在转录后水平调节基因表达。已经证实miRNAs在包括T2D的多种人类疾病中具有重要意义,而且表现出与健康状态下不一致的异常表达谱。miRNA也存在于人的循环血液系统中,能够从外周血中稳定检测；在对T2D的研究中,组织标本(特别是胰腺组织的标本)极难获得,因此如果外周血miRNA能够作为临床标记物应用,这对于T2D患者将具有更为显著的意义。 本研究分析了从易感个体到确诊T2D患者的发病过程中,7个糖尿病相关miRNA在外周血中的表达情况。miR-9可以负性调节胰岛素的释放；miR-124a2的表达会降低胰岛素mRNA水平；miR-375过表达可以抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌,而抑制内源性miR-375的功能则能加强胰岛素分泌；miR-29高表达于胰岛素作用的靶组织,其过表达能够明显抑制胰岛素诱导的葡萄糖摄取,产生胰岛素抵抗；miR-30d在高浓度葡萄糖环境中表达上调,增加胰岛素基因的表达,而抑制miR-30d则能消除葡萄糖诱导的胰岛素基因转录；miR-34a上调损伤营养素介导的胰岛素分泌,而上调的miR-146促进p细胞凋亡的发生,棕榈酸酯对β细胞的损伤有可能与miR-34a和miR-146有关。 目的 探讨2型糖尿病(type2diabetes,T2D)发病过程中,在从糖尿病易感个体到糖尿病前期再到显性糖尿病的不同阶段,7个糖尿病相关microRNA(miRNA;miR-9,miR-29a,miR-30d,miR-34a,miR-124a,miR-146a, miR-375)在外周血中的表达及临床意义；研究pre-diabetes阶段T2D相关miRNAs的表达特点,及利用T2D相关miRNAs表达谱分析预测pre-diabetes阶段病程转归的可能性。 方法 研究对象：本研究共包括56例研究对象,18例为初发2型糖尿病患者(newly diagnosed T2D, n-T2D);19例为pre-diabetes个体,包括IGT和／或IFG；19例糖耐量正常的T2D易感个体(T2D-susceptible individuals with normal glucose tolerance, s-NGT)。 i诊断:采用2小时75克葡萄糖OGTT实验。患者于空腹及服糖后2小时采集肘静脉血,检测血浆葡萄糖(plasma glucose, PG)。糖耐量依照以下标准评判：糖耐量正常(FPG5.6mmol/1且2小时PG7.8mmol/1)；单纯IFG(FPG5.6-6.9mmol/1且2小时PG7.8mmol/1)；单纯IGT(FPG5.6mmol/1且2小时PG7.8-11.0mmol/1), IFG+IGT (FPG5.6-6.9mmol/1且2小时PG7.8-11.0mmol/1), n-T2D (FPG≥7.0mmol/1和／或2小时PG≥11.1mmol/1) 检测：采用mirVana Column法提取血清总RNA；采用ABI公司TaqMan(?) MicroRNA Assays检测试剂盒,以荧光定量实时RT-PCR (real-time RT-PCR)法检测血清miRNA水平； 统计分析：以One-way ANOVA或者卡方检验检测三组研究对象间RNA浓度以及年龄、性别分布、BMI、血糖及血脂等指标的差异；以待测miRNA与内参RNU6B之间阈值循环数(threshold cycle, Ct)之差(ACt)来表示各个]miRNA的相对表达水平,三组间miRNA表达水平的比较采用one-way ANOVA及随后的LSD组间两两比较；以典型判别分析(canonical discriminant analysis)和凝聚层次聚类分析(agglomerative hierarchical cluster analysis)研究比较三组间7个miRNAs整体表达谱的差异。所有统计分析均为双侧,显著性以P0.05为标准。 结果 临床资料:三组研究对象在性别分布、年龄、BMI方面均无显著性差异。从s-NGT组到pre-diabetes组再到n-T2D组,空腹血糖和餐后两小时血糖均呈现逐步升高的趋势,差异均具有统计学意义；甘油三酯(triglyceride, TG)水平也呈逐步升高的趋势,差异同样具有统计学意义。 三组对象血清标本中7个miRNA均可稳定检测：所有标本中均可提取出满足后续niRNA qRT-PCR检测所需的总RNA,且三组间所提取RNA的浓度无显著性差异(s-NGT组：7.311±0.6852；pre-diabetes组：9.429±1.880；n-T2D组：7.407±1.223；单位：ng/μl；均数±标准误,P=0.4626；one-way ANOVA). qRT-PCR检测步骤中,56例血清样本中的绝大多数,其7个miRNA和RNU6B均显示出可靠的Ct值；在约3%的检测中,待测miRNA的荧光信号经过40个循环的扩增后仍未达到所设定的阈值强度,其Ct值按照所设定的循环数的上限(40)计算。 n-T2D组血清标本中7个miRNA水平均显著升高：与s-NGT组相比较,在n-T2D组血清标本中,所检测的7个miRNA表达水平均显著升高(miR-9,P=0.0410；miR-29a,P=0.0030；miR-30d,P=0.0180；miR-34a,P=0.0000；miR-124a,P=0.0230；miR-146a,P=0.0080；miR-375,P=0.0040；one-way ANOVA及LSD组间比较)；各miRNA中,miR-34a的表达水平在s-NGT组与n-T2D组之间差距最大。 pre-diabetes组中7个血清miRNA的表达与s-NGT组接近：7个miRNA在pre-diabetes组中的表达模式更接近s-NGT组。与s-NGT组相比,除miR-375之外,6个miRNA的表达水平均显示出一定程度的升高,但它们的表达水平仍非常接近s-NGT组,差异远不具有统计学意义。另一方面,与n-T2D组比较,pre-diabetes组中5个miRNA表达水平显著降低,分别为：miR-9(P=0.0210)、miR-29a(P=0.0030)、miR-34a(P=0.0010)、miR-146a(P=0.0100)以及miR-375(P=0.0020)；其均值差从-2.377±1.552到-3.747±1.285(ΔCt,均数±标准误)。 n-T2D组7个血清miRNA具有特异性的整体表达模式：典型判别分析结果显示,所有7个miRNA中,miR-34a显示出最高的标准化典型判别方程系数,这与前面one-way ANOVA的结果一致,提示miR-34a在各组间的差异最显著。67.3%的研究对象的分组情况得到了正确判别,其中70.6%的n-T2D个体判别正确,而pre-diabetes组和s-NGT组的正确率分别为63.2%和68.4%。在判别方程(P=0.0151,Wilks' Lambda检验)中,s-NGT的中心点(-0.4130)和pre-diabetes的中心点(-0.4980)非常接近,而n-T2D的中心点(1.018)则与二者远离,提示利用判别方程可以较好地判定n-T2D,而对s-NGT和pre-diabetes之间的判别则比较困难。对三组中所有研究对象所进行的凝聚层次聚类分析中,根据所有7个miRNA的表达情况,最终将所有研究对象分成两组,17例n-T2D个体中,有12例聚类在左侧的一组中,而s-NGT个体和pre-diabetes个体的分布则相互混杂在‘起,两组个体均未能呈现明显的聚类。以上结果显示,与s-NGT组合pre-diabetes组相比较,n-T2D组7个血清miRNA的整体表达模式具有相对的特异性。 结论 pre-diabetes组和s-NGT组中,外周血糖尿病相关miRNAs的表达水平相仿,无显著性差异；与pre-diabetes组和s-NGT组相比,当病情发展至显性糖尿病阶段(n-T2D组),外周血糖尿病相关miRNA的表达水平则明显升高,与前两组表达水平具有显著性差异。将7个糖尿病相关miRNAs作为一个整体分析其表达谱的变化,同样发现pre-diabetes组和s-NGT组具有类似的表达谱,典型判别方程不能对二者进行可靠判别,聚类分析则不能对两组个体进行较好的聚类。对于n-T2D组个体,典型判别方程可以较为可靠的进行判别,聚类分析中多数n-T2D个体聚集于同一组。以上结果证明在T2D发病过程中的重要阶段pre-diabetes期,虽然血糖稳态已经出现异常,但基因表达的重要调控因素miRNA的表达水平与表达谱尚未发生明显改变,而是仍处于与血糖正常个体类似的状态,直至疾病进展至显性T2D阶段,miRNA的表达水平与表达谱最终发生显著改变。T2D发病过程中糖尿病相关miRNAs的变化规律提示,在相当一部分pre-diabetes个体中,进展至显性T2D关键的病理生理学改变,即“临界点”尚未发生,这一结果可部分解释在糖尿病前期阶段,通过对生活方式的有效干预能够逆转部分T2D发生的机制。

【关键词】：2型糖尿病 糖耐量减低 空腹血糖受损 正常糖耐量 循环microRNA
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1
【目录】：