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多壁碳纳米管生物学效应的分子机制研究

张逸  
【摘要】:近年来,有关纳米技术(Nanotechnology)的研究蓬勃发展。现今,国际上关于纳米技术的专业学术期刊已有近60种,这些刊物的影响因子年年攀升,从中可见本领域研究的热度。纳米技术的发展高度依赖具有良好性质的纳米材料的开发以及其理化性质的改造。碳纳米管是一种由单层或多层石墨片层卷曲而成的空心柱状碳纳米材料,其优良的理化性质日益引起人们的关注。研究表明,碳纳米管在多个科技领域都具有极大的应用潜力。在生物医学领域,近年的研究亦证实,碳纳米管是一种优良的药物载体,具有载药量大、可方便地实现药物的缓控释、能实现多功能化等引人入胜的特点;另外,它还是一种具有低背景噪音的成像对比剂及高强度的组织工程基质材料,同时,其独特的光学、热学性质还可直接用于杀灭肿瘤细胞。虽然纳米粒子对于人类而言早已不陌生(自然界中存在诸多天然的纳米粒子),但人类对其生物学性质的了解还相当有限,因此人们对潜在的纳米毒副作用予以很大的关注。研究显示,碳纳米管的主要毒副作用包括导致细胞活性氧的产生、诱导炎症、引起细胞凋亡、诱导正常细胞向癌细胞转化,以及导致石棉样毒性等。 碳纳米管的应用潜力及毒性的发生都是在与细胞相互作用的过程中产生的。现在人们已经掌握了碳纳米管在组织与细胞水平上的部分生物学性质,其中包括经由不同途径(例如口服、静脉注射、透皮吸收,以及呼吸作用等)进入动物体内后在各器官分布的规律,纳米材料进入细胞的途径和在亚细胞水平上的定位,以及影响纳米材料分布、吸收、代谢以及排泄等过程的理化因素等,但在更进一步的分子层次上的研究则相对比较缺乏。在这方面,研究最多的是碳纳米管与蛋白质的相互作用,例如碳纳米管表面性质对血清蛋白的吸附规律。这些分子水平上的研究对了解碳纳米管的基本生物学性质具有重要的指导意义,但是,由于大部分研究是在试管内进行的,研究结果无法反映碳纳米管与活细胞作用时的真实情况。例如,膜结合蛋白的功能化立体构像需要细胞膜的支撑作用,一旦这些蛋白离开细胞膜,其结构也会发生改变。因此,研究纳米材料在活细胞中与生物分子的相互作用具有实际的生物学意义。 本论文的第一部分(第2章)内容是开发三种用于研究在活细胞内多壁碳纳米管(以及其他纳米材料)与细胞膜蛋白相互作用的方法。很多细胞膜蛋白参与细胞信号通路的调控,有研究显示纳米材料影响细胞信号通路的传导。纳米材料与细胞接触后分布于细胞膜上或进入细胞,因此,其影响细胞信号通路的作用靶点可能是细胞膜上的蛋白受体,也可能是细胞内的信号传导步骤。虽然后一情况已有少量研究报导,纳米材料是否会作用于细胞膜上的蛋白受体仍然未知,这在一定程度上是由于缺乏有效的研究方法。这部分研究内容是借鉴生物学中用于研究生物大分子之间相互作用的方法来研究多壁碳纳米管与细胞膜受体之间的相互作用。具体方法包括原位的邻位连接技术(in situ PLA),荧光共振能量转移技术(FRET)技术以及免疫金电镜技术。通过构建多壁碳纳米管与细胞膜受体相互作用的实验模型,以及对多壁碳纳米管表面进行适当的修饰,本研究证明上述三种方法可有效地用于研究纳米材料与细胞膜受体的相互作用。这些实验方法将有助于研究纳米材料生物学效应的分子机制以及表面修饰对纳米材料生物学性质的影响规律。 本实验室及其他课题组先前的研究发现,单壁和多碳纳米管能抑制细胞的骨形成蛋白(bone morphology proteins, BMP)信号通路。BMP信号通路包括多个信号传导步骤,我们对碳纳米具体的作用机制还不甚明了。在本论文的第2章中,我们利用在第一章中开发的方法对多壁碳纳米管与BMP信号通路相互作用的分子机制进行了探索。研究结果表明,多壁碳纳米管与2型BMP受体结合,抑制其磷酸化1型BMP受体的激酶活性是导致BMP信号通路活性下调的原因。这一发现的意义在于,明确纳米材料作用于细胞信号通路的机制之一是通过与细胞膜表面受体相互作用的方式,这种相互作用的本质是纳米材料与蛋白的相互作用。这一认识对通过改造多壁碳纳米管表面化学来调节其对细胞命运(例如,干细胞分化)的影响具有理论上的指导作用。 了解碳纳米管自身的生物学活性是充分开发其生物医学用途以及避免潜在毒性的前提。在真核细胞内,BMP信号通路参与调节诸多重要细胞功能。本论文进一步系统地研究了多壁碳纳米管对BMP信号通路介导的一系列生物学事件,这些生物学事件包括干细胞的分化、细胞凋亡以及细胞增殖(细胞周期) 研究碳纳米管对干细胞分化功能的影响不仅具有指导组织工程临床应用的价值,还具有重要的理论意义。这是因为,一方面,研究发现碳纳米管的机械力学以及电学性质十分适合应用于干细胞组织工程中,因此与干细胞相互作用直接影响其作为组织工程基质的生物学表现;另一方面,许多调控干细胞分化及命运的信号通路在肿瘤细胞的生理过程中亦发挥重要的功能,例如,BMP信号通路调节间充质干细胞的多个分化方向,同时,它也在乳腺癌细胞中具有很高的活性。因此了解碳纳米管对干细胞命运的作用规律对其生物医学应用的其他方面亦具有启发作用。基于这一认识,在本论文的第3、4、5章中,我们研究了多壁碳纳米管对间充质干细胞系C2C12的成肌分化的影响。研究结果表明,对BMP信号通路的抑制作用增强了C2C12的成肌分化,而且,这种效应受多壁碳纳米管表面化学修饰的调节。对成肌分化过程中分子事件的逐步分析结果显示,多壁碳纳米管抑制BMP信号通路,导致其靶标蛋白——DNA结合抑制蛋白/分化抑制蛋白(Id)的表达水平下调,这减弱了其对成肌调节因子,一类具有碱性螺旋—环—螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)结构的蛋白的负调控作用,因此加强成肌分化。由于多壁碳纳米管通过抑制2型BMP受体来调节BMP信号的传导过程,基于纳米材料的表面性质决定其与蛋白相互作用的模式与强度这一认识,我们假设改变多壁碳纳米管的表面化学能调节其与膜蛋白相互作用的模式与强度,从而改变依赖受体功能的信号传导。用本实验室先前报导的多壁碳纳米管组合化学库对成肌分化信号的筛选结果证实了这一假设,显示了对纳米材料生物学性质人为调控的可能性。 在本论文的第6、7章中,我们研究了多壁碳纳米管抑制BMP信号通路所导致的另一生物学事件。研究结果发现,多壁碳纳米管诱导的p21蛋白的高表达能抑制多种诱因导致的细胞凋亡,并且是导致细胞周期阻滞的原因。p21蛋白既是一种细胞周期素依赖的激酶抑制剂,参与器官发育过程中及应激条件下细胞周期的调节,又是一种细胞凋亡的抑制因子。本研究发现多壁碳纳米管对BMP信号通路抑制的另一效应是激活p53非依赖途径的p21蛋白的高表达。p21蛋白从细胞核内转移至细胞质中,在线粒体上与凋亡执行蛋白Caspase-3的前体蛋白Procaspase-3结合,抑制其水解活化成有活性的Caspase-3形式,从而抑制细胞的凋亡过程。另一方面,p21蛋白与CyclinD/CDK4,6复合体结合,抑制该复合体对Retinoblastoma (Rb)蛋白的磷酸化作用,导致对细胞周期的阻滞。 细胞对纳米材料的摄入机制是一项重要的研究课题。纳米材料的物理因素,包括尺寸及形状能影响这一过程。在本论文的最后一章中,我们研究了一种具有独特形状——二维盘状的聚合物纳米材料(Nanodisks)的细胞摄入规律及细胞毒性。研究发现,这种独特的形状大大增强了其与细胞膜的相互作用,阻碍细胞的摄入,并影响细胞膜上的磷脂双分子层结构的有序性,因此既使在高浓度下也不导致明显的细胞毒性。这些性质在细胞成像与干细胞分选的应用中具有特殊的应用潜力。


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