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人乳头瘤病毒58型(HPV58)E2蛋白与E7蛋白的直接相互作用及效果研究

王鑫  
【摘要】:目的和意义:人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)属乳多空病毒科A组,为嗜上皮组织的小DNA病毒。目前,人们已经成功分离出了120多个型别的HPV。根据致病性的不同,又可将其分为低危型和高危型。低危型包括HPV-1、2、6、11等,主要引起良性瘤或疣,如扁平疣和尖锐湿疣;高危型包括HPV-16、18、31、45、58等,可以导致恶性肿瘤,是宫颈癌的主要病因之一。 HPV-58是一种重要的高危型HPV,它的流行存在地域差异。流行病学研究表明,HPV-58的感染主要分布在亚洲,尤其是东亚地区,因此欧美学者对其关注较少。我国各地区的流行病学调查显示,无论在宫颈筛查,还是宫颈癌患者中,HPV-58的感染率都仅次于HPV-16和18,有些地区甚至超过HPV-18。但是对HPV-58的病毒生物学及致癌活性的研究却远远落后于HPV-16和18。目前,针对HPV-16和18型病毒的疫苗已经上市,但却不能保护HPV-58的感染。因此,对HPV-58的研究具有很强的现实意义。 HPV基因组全长8kb左右,可分为3个区:长调控区(long control region, LCR)、早期基因区(编码早期调控蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7)和晚期基因区(编码衣壳蛋白L1和L2)。E6和E7是主要的癌蛋白,其致癌机制已经比较清楚,且功能较为保守。而E2蛋白是病毒的转录调控蛋白,功能较为复杂,不仅可以调节E6和E7的转录,还可以和多种宿主蛋白相互作用。最引人注目的是E2蛋白可以抑制E6/E7的表达,从而抑制细胞的恶性转化,但在病毒基因组整合的过程中,常伴随E2基因的破坏,特别在宫颈癌组织中E2常常缺失。因此,E2蛋白的缺失被认为是宫颈损伤由良性转为恶性的关键转折点。然而,E2的功能较复杂,目前还不是清楚其在病毒生活周期中究竟扮演什么角色。其研究结果也主要来自于HPV-16E2和BPVE2。 因此,本研究以HPV-58E2蛋白作为研究对象,试图深入了解58E2蛋白在抑癌方面的分子机制,为进一步研究基于E2蛋白的宫颈癌治疗性疫苗奠定实验基础。 方法和结果:本研究应用GST-pull down发现了HPV-58E2蛋白可以和E7蛋白在细胞外结合,并应用免疫共沉淀进一步验证二者在细胞内的直接相互作用。同时,我们还发现,E2和E7蛋白在细胞内的结合具有HPV型别特异性,即58E2只能与58E7结合,却不能结合16E7;同样,16E2也只能和16E7结合,但不能结合58E7。为了进一步确定58E2和E7结合的结构域,我们构建了一系列58E2的截短型突变体,应用免疫共沉淀分别检测它们与58E7是否存在直接相互作用,结果发现,58E2的N端和C端都不能结合58E7,只有中间的铰链区,特别是其中244-254aa是58E2和58E7结合的关键部位。 在此基础上,我们进一步研究了58E2和58E7的结合对58E7致癌活性的影响。因为HPV E7蛋白结合并降解抑癌蛋白pRb是其致癌的主要机制之一,所以首先检测了58E2是否会抑制58E7对pRb的降解。我们应用E2全长蛋白和58E2的各截短型突变体分别和58E7共转染HaCat和NIH3T3细胞,检测细胞中pRb的稳定水平。结果证明不仅58E2全长蛋白可以抑制pRb的降解,包含铰链区的58E2各截短型突变体都可以不同程度地保护pRb不被58E7降解。接下来又通过免疫共沉淀法检测58E2和58E7相互作用是否会抑制58E7与pRb的结合,分别用58E2NT和缺失pRb结合位点的58E7突变体58E7△22-26作为对照。结果显示,野生型58E7和58E7Δ22-26结合58E2的能力无明显差别,而58E2不会抑制58E7与pRb结合。此外,我们还通过细胞克隆形成实验检测了58E2对58E7诱导的细胞增殖活性的影响。结果发现,包含铰链区的突变体和全长58E2都可以抑制58E7诱导的细胞增殖。 结论:①HPV-58E2和E7蛋白存在直接相互作用,58E2铰链区是结合58E7的关键部位;②E2-E7的结合表现出HPV型别特异性;③HPV-58E2蛋白抑制58E7介导的pRb的降解,进而抑制58E7诱导的细胞增殖活性。 目的:卡波氏肉瘤相关病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus, KSHV)属于γ型疱疹病毒,为有包膜的双链大DNA病毒。是目前所知的七种人类致瘤病毒之一。KSHV可以致卡波氏肉瘤和初级融合淋巴结瘤,常见于艾滋病患者。KSHV病毒颗粒由三层蛋白组成:衣壳、被膜和包膜,由内到外包裹病毒DNA。大部分病毒蛋白位于被膜层,目前已被鉴定的有ORF11、21、23、33、45、52、63、64、75等。 脂筏是动态细胞膜系统中的一部分,广泛参与细胞的信号转导,免疫应答,病毒的感染、组装和释放等多种细胞的生命活动。越来越多的的研究发现许多包膜病毒的结构蛋白可以定位于脂筏,随着脂筏的运动而聚集和运输,参与病毒颗粒的组装和释放。由此,我们推测KSHV可能也以脂筏作为病毒组装释放的平台。 ORF45编码一个407aa的被膜蛋白。仅存在于γ型疱疹病毒中。ORF45不仅可以和多种被膜蛋白相互作用,还可以结合衣壳蛋白和包膜蛋白,它更像是一个病毒结构的组织者。我们以前的研究发现,应用敲除了ORF45的KSHV人工基因组转染细胞后,病毒颗粒的释放明显低于野生型KSHV人工基因组。综合以往的研究,我们推测ORF45在病毒的组装释放过程中一定起着重要的作用。因此,本研究试图从ORF45与脂筏的关系入手,探讨ORF45以脂筏为平台,组织病毒颗粒的组装和释放的机制。 方法和结果:目前。研究脂筏最常用的方法是在低温(4℃)条件下,应用非离子性去污剂分离出抵抗去污剂的细胞膜成分(detergent resistant membrane, DRM),以DRM研究脂筏相关蛋白。我们首先应用KSHV潜伏感染的BCBL-1细胞,经TPA诱导病毒裂解复制,提取DRM检测ORF45。结果显示,ORF45蛋白可以定位于DRM。为了进一步证明,ORF45是自发性的定位于脂筏,而不是通过与其它病毒蛋白相互作用定位于脂筏的。我们在293T细胞中过表达ORF45,提取脂筏依然可以检测到ORF45。接下来,我们构建了一系列ORF45的突变体,检测它们与脂筏的关系,最终发现决定脂筏定位的结构域位于115-332aa,其中297-300aa是脂筏定位的关键位点。 之后,我们应用野生型和ORF45缺陷型的KSHV人工基因组转染293T细胞,建立稳定转染的细胞系,并向ORF45缺陷型的KSHV细胞系中导入ORF45野生型和突变体的表达质粒,再用TPA和Butyrate诱导KSHV裂解复制。收集并纯化培养上清中的病毒颗粒。经Real-time PCR分析病毒基因组拷贝数,结果显示,缺失ORF45的KSHV的病毒基因组拷贝数明显低于野生型的KSHV,仅为野生型的1/10~1/8。但重新导入ORF45后,病毒基因组拷贝数较ORF45缺陷型明显升高,然而,转染不同的ORF45突变体,病毒基因组的拷贝数不同,尤其是脂筏定位区缺陷组与ORF45缺失组没有明显差别。 有研究发现,ORF45可以和核糖体S6激酶(ASK)相互作用,激活ERK信号通路。而且脂筏又广泛参与信号转导。因此,我们还检测了ORF45的各突变体与信号转导的关系。结果显示,除了ORF45的19-77aa与ASK相互作用,可以维持ERK的磷酸化,其它结构域(包括脂筏定位结构域)和ERK的磷酸化无关。 结论:①KSHV被膜蛋白ORF45是一个脂筏相关蛋白,其脂筏定位的关键位点位于297-300aa。②ORF45在KSHV的组装和释放过程中发挥重要作用,ORF45很可能以脂筏为平台,组织病毒颗粒的组装与释放。③ORF45定位于脂筏与细胞内ERK信号通路的信号转导无关。


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