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《山东大学》 2012年
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ITP中自身抗体介导的非补体依赖的血小板凋亡研究

孙琳  
【摘要】:研究背景:免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫介导的、临床较为常见的血小板减少性出血性疾病,近年来其发病机制取得了一些较为重要的进展。自身抗体致敏的的血小板被单核巨噬系统破坏是众所周知的经典的发病机制,血小板糖蛋白(glycoprotein, GP)特异性的自身抗体,大部分主要为针对GPⅡb/Ⅲa和/或GPIb/IX的IgG,该抗体与血小板膜自身GP抗原结合,通过作用于单核巨噬细胞Fc γ受体(Fc γ R)在网状内皮系统被巨噬细胞吞噬而过度清除;近来研究还发现自身抗体介导的巨核细胞成熟障碍也是导致外周血血小板减少的重要原因之一。然而,有学者通过小鼠模型研究发现,抗GPIb/IX抗体引起ITP中血小板的破坏可能是通过一种Fc段非依赖机制。也有研究提示在HIV-1相关的ITP患者,HIV-1抗体作用于血小板整合糖蛋白GPⅢa49-66可诱导非补体依赖作用的血小板微粒形成,其发病机制与活性氧(ROS)的诱导产生有关。目前,对于ITP患者血浆抗GPⅡb/Ⅲa和/或GPIb/IX两种特异性自身抗体导致血小板凋亡的体外研究,国内外尚未见报道。 目的:应用改良MAIPA技术检测ITP患者血浆中的特异性血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)自身抗体水平,通过蛋白A琼脂糖亲和层析柱制备和纯化血浆IgG以去除补体,流式细胞术检测ITP患者的IgG对正常血小板凋亡及血小板微粒形成的影响,并比较不同类型膜糖蛋白特异性自身血小板抗体在非补体依赖条件下对正常血小板的作用。 方法: ◆收集慢性ITP患者,通过改良单克隆特异性俘获血小板抗原技术(MAIPA)对血小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ)特异性自身抗体进行检测。 ◆通过蛋白A琼脂糖亲和层析柱制备和纯化血浆IgG,采用分光光度法对纯化的IgG进行浓度的测定。 ◆收集正常人血小板并计数,1×107血小板/管,各管分别加入纯化IgG抗体2mg (GPⅡb/Ⅲa单阳,GPⅠb/Ⅸ单阳,双阳,正常人)及不含IgG的缓冲液。37℃含5%C02孵箱中共孵育4小时。 ◆通过线粒体膜电位改变,PS外翻及血小板微粒形成三种途径,进行流式细胞术检测血小板凋亡 结果: ◆应用线粒体膜电位检测试剂盒检测血小板凋亡,流式细胞仪检测结果发现:GPⅠb/Ⅸ抗体阳性ITP患者的血浆纯化IgG可促进正常血小板凋亡(II组:30.35±19.17%)明显高于GPⅡb/Ⅲa抗体阳性者(I组:9.47±9.70%,p0.05)、健康对照(control组:10.52±12.0%,p0.05)及空白对照(buffer组:12.13±18.51,p0.05)。GPⅡb/Ⅲa抗体阳性ITP患者的血浆纯化IgG对血小板凋亡与健康对照无显著差异,p0.05。 通过检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,应用Annexin V试剂盒检测血小板凋亡,进一步证实了上述结果。 ◆通过PE-cy5-CD61标记血小板进行流式细胞仪检测,X轴代表荧光强度,Y轴代表前向光散射(FSC),我们可观察到GPⅠb/Ⅸ抗体阳性血浆纯化IgG可促进血小板微粒(PMP)形成,即荧光强度降低,细胞颗粒减小(Ⅲ组:53.0±23.3%vs control组:31.3±18.5%,p0.05)。GPⅡb/Ⅲa抗体及GPIb/Ⅸ抗体双阳的患者血浆纯化IgG、GPⅡb/Ⅲa抗体单阳性的患者血浆纯化IgG对血小板微粒形成与健康对照无显著差异,p0.05。 ◆患者GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的血浆纯化IgG和正常人的血浆纯化IgG,分别与血小板共同孵育后,通过CD62P-FITC和CD63-PE共同标记血小板,进行流式细胞仪检测。结果显示,GPⅠb/Ⅸ抗体阳性ITP患者血浆纯化IgG对血小板活化与健康对照无显著差异。 结论: ◆ITP患者血小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ特异性自身抗体可通过非补体依赖途径介导血小板凋亡,而GPⅡb/Ⅲa特异性自身抗体无此作用。 ◆GPⅠb/Ⅸ抗体阳性ITP患者血浆,其血浆纯化IgG可促进血小板微粒(PMP)形成,且与血小板活化无关。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R554.6

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