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《山东大学》 2012年
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肿瘤细胞自噬与肿瘤细胞抗药性机理的初步研究

解艳艳  
【摘要】:自噬又称为二型细胞死亡(type Ⅱ cell death),是细胞程序性死亡的一种,其特征是自噬体的聚集。自噬体是一种吞入细胞器、细胞质的双层膜结构,它与溶酶体融合形成自噬溶酶体。在溶酶体酶的作用下,自噬体吞入的细胞成分被降解,该过程具有清除受损细胞器及异常蛋白质的重要作用。遭受过度自体消化的细胞便以凋亡或/和非凋亡的形态学特征走向死亡。环境诱因(如饥饿、高温、氧化应激、激素刺激)或细胞内压力(受损细胞器、变异蛋白质聚集和微生物侵蚀)会激活细胞自噬的信号通道。 自噬与肿瘤密切相关,对肿瘤细胞的作用是双向的。当肿瘤细胞在长时间饥饿、低氧以及在放疗和化疗药物作用下,导致细胞内受损细胞器增多、蛋白质氧化、变异或错误折叠的蛋白质聚集等情况时,肿瘤细胞通过自噬途径降解细胞内受损的细胞器和异常蛋白,并将所产生的降解产物重新利用,从而为细胞合成新的结构提供原料,同时避免细胞进入凋亡途径,维持肿瘤细胞的生存。在临床上,常表现出对放疗和化疗的抗性而大大降低了治疗效果。但是,过度的自噬可以导致肿瘤细胞自噬性死亡或凋亡。所以,探讨自噬对肿瘤细胞增殖、死亡和凋亡的影响,为消除自噬对肿瘤细胞的保护作用、探寻旨在通过干预细胞自噬而起作用的协同抗肿瘤药物提供理论依据;为临床上利用现有的自噬诱导剂或抑制剂作为放、化疗的增效药物提供方法和实验依据,因此,从事该方面的研究具有重要的理论意义和社会效益。 本实验以自噬标记蛋白LC3的含量为指标,检测了中国人常见的喉癌、下咽癌和乳腺癌等实体肿瘤内自噬的情况,并且研究了热休克蛋白HSP70, HSP90在肿瘤中的表达情况以及与肿瘤自噬的关系。结果发现,在所检测的三种癌组织共25例标本中均表达LC3蛋白,说明在肿瘤细胞中,自噬具有一定的普遍性。对9例下咽癌标本的分析显示,LC3在肿瘤中心部位的表达量显著高于正常粘膜部位的表达量。HSP70泛表达于被测的标本中,HSP70在正常粘膜和癌边缘组织中的表达量要高于癌中心组织的表达量。HSP90在喉癌、下咽癌的中心组织中高表达,正常组织中不表达或表达量很低。在14例乳腺癌样本中有12例样本中HSP90高表达;同时,在9例下咽癌样本中,可观察到HSP90表达量与LC3有一定的相关性。 由于实体肿瘤内部的细胞往往处于缺血,缺氧以及生长因子供应不足的状态,容易诱发肿瘤细胞的自噬,所以我们以缺氧和无血清培养A549人类肺癌细胞的方式,体外模拟实体肿瘤内部的环境,研究了缺氧和无血清培养对A549细胞自噬的影响。结果发现,无血清和氮气培养7小时后,脱落漂浮和死亡的细胞逐渐增多,未脱落的细胞内自噬活性增强,通过消化细胞内物质和细胞器等维持细胞的生存,导致细胞体积减小,该结果与在体肿瘤细胞的表现相似。 通过Western blotting检测LC3的量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、吖啶橙染色显示酸性膜泡以及电镜观察自噬泡形成等手段,研究了临床上常用的抗肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶对A549细胞自噬的影响,发现低浓度(1-10mg/L)5-氟尿嘧啶处理可以诱发A549细胞产生自噬,高浓度(10mg/L)5-氟尿嘧啶处理主要导致细胞的死亡。进一步研究证明,5-氟尿嘧啶与常用的自噬抑制剂3-MA共同作用时,抑制细胞增殖的能力比5-氟尿嘧啶单独作用更强,说明在抑制细胞自噬的情况下,可在一定程度上增强5-氟尿嘧啶抗肿瘤的效果。通过对酸性膜泡的形成时间和协同效率进行比较,初步发现,5-氟尿嘧啶作用A549细胞的48h内,酸性膜泡形成最多,而在此时间内,3-MA对5-氟尿嘧啶的增效作用也最强,表明抑制自噬可以增加5-氟尿嘧啶对A549细胞的杀伤作用。另外,低浓度的5-氟尿嘧啶在诱导A549细胞产生自噬的过程中,并没有引起HSP90、HSP70表达的变化,是需要进一步研究的课题。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R730.2

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