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《山东大学》 2012年
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以木质纤维素为原料发酵生产丙酮丁醇的过程以及科学机理研究

张杰  
【摘要】:随着石油资源短缺、石油价格的不断上扬、以及人们对能源、环境问题重视程度的提高,生物丁醇作为能源产品正在受到越来越广泛重视。本文以玉米芯为原料进行了丁醇发酵研究。同时分别对玉米芯原料的湿磨预处理工艺、酶水解底物的粒径分布与木质纤维素酶水解速率的相关性、利用梭菌生产丙酮丁醇时葡萄糖与/或木糖的消耗速率以及不同碳源对于梭菌相关基因的转录水平的影响、玉米芯水解液发酵产丁醇的工艺等进行了研究。这些研究成果为发展木质纤维素原料生产丁醇技术提供了理论基础。 本论文的主要研究结果如下: 1.酶水解底物粒径分布和木质纤维素酶水解速率相关性的研究 利用湿磨法对玉米芯原料进行预处理,并对湿磨预处理次数、磨盘间隙等对预处理效果的影响进行了比较。通过酶解反应对预处理效果进行验证,葡萄糖与木糖的得率分别为71.3%和39.1%,还原糖得率较之未经湿磨预处理组提高了2.24倍。分析发现,物料湿磨预处理前后并不会生成糠醛和5-羟甲基糠醛等对后续发酵有抑制作用的抑制物,水解液可以直接用于后续发酵过程。另外,通过SEM分析预处理前后样品,发现湿磨预处理不仅能够使原料粒径大幅度减小,同时能破坏原料的致密结构,使原料呈现絮状,纤维结构大大暴露,增加了纤维素酶与纤维素链的接触面积。而X射线衍射试验表明,湿磨预处理方法对于原料纤维素结晶度影响不大。通过粒径分布研究,发现粒径分布的Frequency90%值能够快速且准确的判定湿磨预处理过程的终点,为湿磨预处理方法的工业化应用奠定了基础。 2.湿磨预处理玉米芯原料发酵生产ABE研究 本研究直接利用湿磨预处理玉米芯原料水解液发酵生产ABE,其发酵过程与纯糖作为碳源的对照组相比较,发现前者的发酵速率没有被抑制,说明在预处理过程中没有产生抑制微生物生产丙酮丁醇的毒性物质。预处理后的原料无需进行脱毒处理便可直接用于ABE发酵,大大简化了操作程序并降低了生产成本。 当以30g/L葡萄糖为唯一碳源时,经过60h发酵,葡萄糖基本耗尽,ABE生产速率与得率分别为0.20g/L.h和0.36g/g还原糖。当以35g/L葡萄糖与25g/L木糖组成的混合糖作为碳源时,经过72h发酵,结束时仍有44%的木糖剩余,ABE生产速率与得率分别为0.22g/L.h和0.35g/g糖。玉米芯水解液发酵过程(SHF) ABE生产速率与得率分别为0.17g/L.h和0.34g/g还原糖,与葡萄糖组及混合糖组相似。结果说明湿磨预处理玉米芯原料可以用于发酵生产ABE。相对于SHF工艺中0.12g/L·h的ABE生产速率,SSF中的ABE生产速率较高,为0.15g/L.h。分析原因,可能是因为SSF中同步糖化与发酵过程中水解产生的单糖被转化成丙酮丁醇,消除了底物抑制,从而提高了底物水解效率所致。通过对SHF与SSF两种工艺中物料与能量进行衡算,SSF工艺中的能量得率为142%,高于SHF工艺的112%。上述结果表明,湿磨法是一种温和的预处理方法,预处理过程中不会生成对后续发酵有抑制作用的副产物,减化了工艺的后续脱毒过程并降低了成本,经过其处理的玉米芯可以被用作生产ABE的原料。 3.同步利用混合糖生产丙酮丁醇菌糖代谢特性研究 通过富集、分离获得一株能够同步代谢葡萄糖与木糖产丁醇的菌株,经过形态及16S rRNA分析,初步鉴定为Clostridium beijerinckii,命名为SE-2。菌株SE-2分别以葡萄糖或木糖为碳源时的糖初始利用速率分别为0.8g/L·h和1.0g/L·h,两种糖的利用速率基本相同。改变培养基中葡萄糖与木糖比例为1:2,2:1与1:1,发酵过程中两种糖仍能同步利用,而且糖利用速率基本一致,分别为0.57g/L·h、0.55g/L·h和0.56g/L.h。此外,利用补糖方式对SE-2的葡糖糖与木糖利用特点研究发现,当发酵过程由单糖转化为双糖时,原有单糖的利用速率下降,但是双糖的利用速率之和基本维持与补糖前一致,说明只要有葡萄糖或者木糖存在,SE-2便能立刻启动对该糖的代谢过程。发酵过程动力学分析进一步说明,菌株SE-2不仅可以同步利用葡萄糖与木糖,而且木糖初始代谢速率要略高于葡萄糖。 4. C.beijerinckii SE-2发酵玉米芯水解液产丁醇条件的优化 以玉米芯水解液为原料,进行了C.beijerinckii SE-2生产丁醇发酵工艺优化实验研究。首先通过单因素法对产丁醇条件进行了初步优化,然后通过响应面设计对培养基进行进一步优化,最后获得优化工艺条件。在此条件下,丁醇浓度达到11.71g/L,比优化前提高42%。在优化条件下进行玉米芯水解液发酵生产丁醇的验证实验,分批次发酵(5次),丁醇产量平均值为11.65+0.47g/L,实验值与理论预测值非常接近,可见该模型可以较好地预测C. beijerinckii SE-2利用玉米芯水解液产丁醇的实际发酵情况。菌株优化后将酵母粉替换为相对便宜的玉米浆,这为工业化放大奠定了基础。 5.利用梭菌生产丙酮丁醇时葡萄糖与/或木糖的消耗速率以及不同碳源对于梭菌相关基因的转录水平的影响 本研究中利用RT-qPCR对C. beijerinckii SE-2中10个与木糖代谢相关的基因(Cbei4126、Cbei0549、Cbei4455、Cbei2657、Cbei0109、Cbei2389、Cbei4457、 Cbei_4448、Cbei_2385和Cbei_2384)在不同碳源条件下的转录差异进行了分析。发现这些基因在不同碳源(葡萄糖、木糖或葡萄糖与木糖)发酵过程中在转录水平上是有差异的且都受葡萄糖阻遏。其中基因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389可能存在于同一操纵子上,参与了木糖至5-磷酸-木酮糖转化过程。与文献报道中C. beijerinckii相关基因转录情况不同,基因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389在混合糖发酵过程中转录水平明显下降,说明“葡萄糖阻遏效应”在菌株C. beijerinckii SE-2中依然存在。通过分析,推测菌株C. beijerinckii SE-2葡萄糖与木糖同步代谢的关键因素可能存在于葡萄糖与木糖代谢的共用代谢路径之一,即由丙酮酸至产物合成的途径上。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ920.6

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