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《山东大学》 2013年
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微乳液中酶催化性能研究

薛鲁燕  
【摘要】:酶是具有催化活性的蛋白质。酶催化反应具有许多优点,如反应速率快、立体选择性好、反应条件温和等。利用酶催化反应进行物质的合成与转化是生物学与化学交叉研究的热点领域。在实际体系中,酶活性的保持与提高是生物合成与转化的关键。由于酶活性依赖于其存在的介质或微环境,因此,寻找适宜于酶活性保持或提高的介质或微环境一直是科研工作者追求的目标。与单一有机溶剂相比,油包水微乳液(W/O)作为酶催化反应介质能在分子水平上分散酶,其大的界面积、增强的底物溶解性也使得疏水性底物与亲水性酶之间的反应变得极为有利。此外,由于界面膜的保护作用,有机溶剂导致的酶失活作用大大降低。因此,W/O型微乳液(低水含量W/O微乳液也称为反胶束)常常成为酶催化性能研究的首选介质。 相对于挥发性有机溶剂,低挥发性的离子液体常常被看成是绿色溶剂。有关离子液体作为酶催化反应添加剂和介质的研究已有报导。作为添加剂,特定性质的离子液体能增强酶的催化性能。作为介质,低挥发性的离子液体比传统有机溶剂具有许多优势。譬如,在离子液体介质中,酶的催化性能(包括活性、稳定性和立体选择性)通常要优于传统有机溶剂介质;不仅如此,在离子液体介质中,产物易于分离、酶和离子液体可重复利用。为提高反胶束中酶催化性能、减少挥发性有机溶剂的使用,本文尝试开展了如下几方面创新性研究: 1.传统反胶束中亲水离子液体增强脂肪酶催化性能研究 传统反胶束在脂肪酶催化的生物合成和转化中应用广泛,但脂肪酶的催化性能仍需改善。已有文献表明,水介质中低浓度离子液体能增强酶的催化性能。通常认为,由结构形成阴离子和结构破坏阳离子组成的离子液体有利于蛋白结构稳定。对酶催化反应而言,离子液体的可设计性为通过选择合适的离子液体阴离子和阳离子来提高酶的催化性能(包括活性,稳定性和选择性)带来了便利。胆碱醋酸盐是由稳定蛋白的结构形成阴离子和结构破坏阳离子组成的离子液体,根据Hofmeister序列,稳定蛋白的结构形成阴离子和结构破坏阳离子有利于酶催化性能的保持。在这里,我们首次研究了胆碱醋酸盐对AOT/异辛烷/水反胶束中脂肪酶催化对-硝基苯丁酸酯水解活性和稳定性的影响。结果表明,加入的胆碱醋酸盐不影响反胶束的结构,但能提高脂肪酶的催化性能。荧光光谱研究表明高浓度胆碱醋酸盐对脂肪酶构象有一定的影响,但此时脂肪酶活性也是增强的,所以胆碱醋酸盐对反胶束中脂肪酶的激活作用主要是提高了水亲核性。红外光谱表明胆碱醋酸盐能和脂肪酶周围的水形成强氢键,提高水的亲核性,使其更容易进攻酰酶中间体,从而提高了脂肪酶催化酯水解的活性。含有胆碱醋酸盐的AOT反胶束中脂肪酶稳定性的研究也表明,由稳定蛋白的结构形成阴离子和结构破坏阳离子组成的离子液体在一定程度上能保持脂肪酶催化活性。 2.新型疏水离子液体基微乳液的构建及其中的酶催化反应 在疏水性离子液体介质中,酶有催化活性,但不能在单分子水平上分散,也因此大大降低了酶催化效率。因此,尝试构建一个适宜于酶活力表达的疏水性离子液体/酶均相体系是一项很有意义的工作。基于此我们绘制了新的AOT/Triton X-100/H2O/[Bmim][PF6]拟三元体系的相图。借助非离子表面活性剂Triton X-100,AOT可以分散在疏水性离子液体[Bmim][PF6]中,并形成较大区域的单相微乳液。通过探针K3Fe(CN)6在单相微乳液相区中扩散系数随含水量的显著变化,区分了water-in-[Bmim][PF6](W/IL)微乳液相区。通过探针CoCl2的紫外可见吸收光谱证明了W/IL微乳液的存在。结合W/IL微乳液各组分的红外光谱特征,通过用重水取代普通水首次用FTIR证明含有较大ω0的W/IL微乳液中本体水的存在(ω0定义为体系中水与表面活性剂的摩尔比)。该W/IL微乳液不仅能增溶无机盐CoCl2,也能增溶生物大分子(漆酶)。增溶的漆酶在该微乳液中能表现出较高的催化活力,而且通过改变反相微乳液内界面的组成漆酶的催化活性能得到很好的调控。 在AOT和TX-100稳定的water-in-[Bmim][PF6]微乳液中,我们也研究了脂肪酶催化对-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate (p-NPB))水解的活力。探讨了微乳液的结构参数和酶催化反应的条件对脂肪酶催化活性的影响,尤其是Tris-HCl缓冲液浓度的影响。在最佳条件下,该体系中脂肪酶的催化活性比水饱和的离子液体[Bmim][PF6]中高。分析表明,这是由于反相微乳液大的界面,高的水活性(分子间氢键),和水池中咪唑阳离子(Tris+阳离子与[Bmim]+|阳离子交换)的激活作用所致。当考虑底物在微乳液胶束拟相中的分配,在此新型微乳液中脂肪酶的催化效率是水饱和离子液体[Bmim][PF6]中的14.3倍。为了证明离子液体基微乳液在生物催化合成中的应用价值,我们研究了脂肪酶催化的醋酸乙烯酯和苯甲醇的转酯化反应制备芳香剂乙酸苄酯。由于反胶束大的界面,高的水活性,和水池中咪唑阳离子的激活作用使分子水平上分散的酶催化效率大大提高,加之副产品的移除,苯甲醇的转化率高达94%。 3.传统反胶束中牛血清白蛋白构象的氰基红外探针表征方法 反相微乳液中酶构象的表征是胶束酶学研究的一个重要内容。圆二色光谱是表征蛋白构象的常用方法,但是,反胶束中离子液体的引入可能干扰蛋白构象的测定,因此表征蛋白的各种谱学方法值得开展。红外光谱是测定生物分子结构的一种重要技术手段。它适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白质和/或多肽的测定,但是存在光谱拥挤现象。蛋白质在2500-2200cm-1区域没有红外吸收,在蛋白分子上修饰红外吸收频率在此区域的红外基团为蛋白构象研究带来了便利。非天然分子4-氰基苄基溴是一个对溶剂环境变化很敏感的红外探针。我们通过牛血清白蛋白(BSA)上半胱氨酸巯基的烷基化反应将4-氰基苄基基团修饰到牛血清白蛋白上,圆二色光谱研究表明BSA修饰前后构象基本保持。利用尿素等改变BSA构象,研究了AOT反胶束中氰基红外吸收峰对BSA构象变化的敏感性;通过改变反胶束大小,电解质浓度等探讨了氰基峰裂分的机制。氰基红外吸收峰的位移及其裂分与BSA结构的变化具有关联性。上述结果不仅为利用氰基红外探针研究增溶在离子液体基微乳液中的蛋白质或酶的构象奠定了基础,还为离子的Hofmeister序列研究提供了新思路。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:O643.3

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【参考文献】
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