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《山东大学》 2013年
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EYES ABSENT和SINE OCULIS在黑腹果蝇眼睛发育过程中的功能研究

靳梦  
【摘要】:眼睛的发育和生成取决于“眼睛决定基因网络”(Retinal Determination Gene Network, RDGN),此网络由高度保守的基因组成,能够编码对于眼睛生成必不可少的转录因子和相关的辅助因子。Eya absent (Eya)和Sine oculis (So)是RDGN的重要成员,两者可以相互结合形成转录调节复合物,在果蝇乃至人类的多种发育过程中起作用,包括细胞的分化、增殖和存活等。Eya既是转录共激活子也是蛋白磷酸酶,而它的结合蛋白So行使转录因子的功能。已有的研究表明,eya和so基因对于果蝇的存活和眼睛的生成是必须的,过量表达还能诱导易位眼的生成。尽管eya和so在后生动物发育中的地位如此重要,但目前对其调节及其作用的机制却知之甚少。鉴此,我们的研究立意于从两个方面拓展对Eya和So的认识和了解:利用基因组拯救系统对Eya进行结构—功能分析;并应用染色质免疫共沉淀联合高通量测序(ChIP-seq)筛选So全新的靶基因。主要研究成果如下: 研究发现,Eya的酪氨酸磷酸酶活性对于果蝇的发育和存活不是必须的。果蝇的eya基因编码3种不同的蛋白亚型,这三种亚型都含有两个主要的功能结构域:高度保守的编码271个氨基酸的碳端结构域,即Eya Domain1(ED1);中度保守的Eya Domain2(ED2),它存在于一个富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸的区域(PST)中。EDl保守结构域具有酪氨酸磷酸酶活性,体外催化活性检测显示小鼠和果蝇,甚至植物Eya都具有此活性。但不同的是,果蝇Eya的酪氨酸磷酸酶活性很低,难以检测。大量已有研究结果表明,Eya酪氨酸磷酸酶功能参与调节哺乳动物的发育过程。在果蝇中,相应活性位点的突变会导致酪氨酸磷酸酶活性急剧下降或丧失、基于eya cDNA的异位眼诱导率和遗传拯救率大幅度降低。另外,Eya酪氨酸磷酸酶活性还参与感光细胞轴突的定位。虽然以上研究表明Eya酪氨酸磷酸酶活性可能在果蝇眼睛发育过程中行使功能,但是这一假设却未在能精确模拟内源eya表达量、表达空间、表达时间上的系统中检测过。 基于以上分析,我们构建了3种酪氨酸磷酸酶失活型eya基因组拯救质粒。前两种是单点突变,利用两步式重组法在野生型eya基因组拯救质粒(eya+GR)上引入点突变D493-N (GAT-AAT)和E728-Q (GAG-CAG),即eyaD493NGR和eyaE728QGR。为了研究D493N、E728Q两种点突变同时作用的效果,我们又构建了第三个质粒,eyaNQGR (下文中统称为eya*GR)。通过φC31整合酶系统介导eya基因组拯救质粒上attB位点和果蝇第三条染色体上attP位点之间的重组,从而将eya基因组拯救质粒整合于果蝇体内。然后通过一系列杂交,检测在眼特异性突变eya2(果蝇存活但是无眼)背景下和eya无效突变eyaclillD/Df(2L)BSC356(果蝇无内源性eya,胚胎致死)背景下,eya*GR对果蝇发育和存活的影响。与已有报道相悖,我们的研究结果表明,Eya的酪氨酸磷酸酶活性对于果蝇的发育和存活无影响;转基因拯救型果蝇表现出正常的繁殖能力、生活力、复眼内外部表型、眼成虫盘发育、眼对光的反应和感光细胞轴突定位。 针对Eya特异性结构域和特定位点的结构—功能研究已经有所开展,并取得了初步进展。但是,以往的研究具有一定的缺陷,其主要基于cDNA转基因技术(异位眼诱导、热激诱导等)——基因在表达的时间、空间和表达量上都与内源基因的表达不一样。我们的研究结论改变了人们对Eya功能已有的根深蒂固的认识,并指出了在生物正常发育系统中研究基因功能的重要性,也为将来Eya蛋白以及其他蛋白功能的研究提供了新思路。 研究揭示,Eya的转录激活结构域对于果蝇的发育和存活是必须的。Eya的PST结构域包含一个ED2结构域和两个MAPK磷酸化位点。ED2位于PST结构域的中央位置,研究发现其具有苏氨酸磷酸酶活性,能够参与果蝇和哺乳动物固有免疫的调节,但不调节发育过程。关于MAPK磷酸化位点,最新的体内研究表明,这两个位点磷酸化与否对果蝇的发育和存活没有影响。体外荧光素酶报告实验检测Eya的转录活性,发现不论是在果蝇还是小鼠中,PST结构域对于转录激活是必须的。另外,缺失整个PST结构域会导致eya异位眼诱导率急剧下降。虽然PST结构域对于Eya行使转录激活功能十分重要,缺失会影响果蝇异位眼发育,但是此结构域却未在正常发育系统中检测过。 基于以上分析,我们利用一步重组法构建了PST结构域缺失型eya基因组拯救质粒,简称eya△PSTGR与整合酪氨酸磷酸酶失活型eya*GR一样,通过φC31整合酶系统,将eya△PSTGR插入果蝇第三条染色体的attP位点上。然后,通过一系列杂交实验,检测在眼特异性突变eya2背景下和eya无效突变eyaclillD/Df(2L)BSC356背景下eya△PSTGR对果蝇发育和存活的影响。我们的基因组DNA拯救实验和FRT-FLP嵌合克隆分析结果表明,eya△PSTGR无法拯救eya眼特异性突变和无效突变。RT-PCR和Western Blot结果显示突变基因eya△PST在转录和蛋白水平上都有表达,另外免疫组化染色表明检测的时间点越早,蛋白表达水平越接近野生型。这说明拯救失败并不是Eya蛋白无表达造成的,而是由于PST结构域缺失造成的。换言之,eya的PST转录激活结构域对于果蝇的存活和发育是必须的。 研究表明,So参与调节与果蝇眼睛发育相关的多个基因。转录因子So是被广为认可的Eya结合蛋白,So是SIX (Sine oculis homebox)转录因子家族的重要成员,存在于所有的后生动物中并行使重要功能,它具有2个保守结构域:199个氨基酸的SIX结构域(SD),参与调节蛋白间互作;60个氨基酸的DNA结合同源结构域(HD)。在果蝇中,So对于果蝇的存活、精子发生和整个视觉系统(包括眼睛、视叶、幼虫的视觉器官)的发育是必不可少的。尽管So地位重要,我们对其直接作用的靶基因却知之甚少,大多数己知的So靶基因都能编码转录调节因子,参与眼睛发育。 为了更好地了解So调节眼睛发育的机制,我们联合染色质免疫共沉淀和高通量测序(ChIP-seq),通过对三龄期眼成虫盘上DNA与So蛋白相互作用的全基因组分析,我们发现了7566个So富集区域,大约5400个基因,其中也包括已经被报道的So靶基因。另外,qPCR结果也再次验证了So ChIP-seq指出的靶基因。应用基因本体论(GO)进一步分析这些So结合基因并从中选取了一部分与眼睛发育相关的基因,通过ey-flp/FRT技术对它们的突变型进行分析,最后筛选出了8个全新的So靶基因。 这8个靶基因的基因突变显示出不同的眼表型,有的是粗糙眼,但是眼睛大小无变化;有的是几乎整个眼睛都缺失——这反映了So参与眼睛发育的多个阶段,从细胞存活到MF的发生和发展。这些靶基因如下:2个编码RNA加工蛋白的基因(omd和Syp);2能够编码个转录因子的基因(CG8108and l(3)j2D3):1个编码RabGGT亚基(调节细胞内囊泡运输)的基因(CG12007);1个编码跨膜转运蛋白的基因(blot);2个编码未知功能Armadillo-like折叠和WD40蛋白的基因(CG2747和CG13192).本研究扩大了So靶基因的范围,提出了8个新的候选基因,对于今后So功能的研究影响深远。
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