STING蛋白的初步晶体学研究

【摘要】：STING蛋白是天然免疫一型干扰素生成通路中的一个衔接调控蛋白,在细菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反应中都发挥着重要的调控作用[1]。近来研究发现,STING可以作为免疫感受器识别结合来自病原菌中的第二信使分子c-di-GMP而激活下游通路。之前的研究预测STING蛋白要包含一个预测的N端五次跨膜部分(1-173aa)和C端胞内可溶性的胞质结构域(174-379aa)。有关N端的功能目前仍不清楚,可能与其在细胞内的定位有关,如之前的研究中发现其可能定位于线粒体或内质网膜上。C端胞质结构域(C-terminal domain,CTD)可通过募集相互作用分子而发挥重要的信号调控作用。STING蛋白的氨基酸序列与PDB中任何已知结构的蛋白质都没有同源性,预示它可能拥有独特的三维结构。为闸述STING接受c-di-GMP信号而发挥功能的分子机制,我们利用x-射线晶体学方法对其进行了结构生物学的研究。 首先,通过对不同STING蛋白的片段在大肠杆菌内的表达分析,我们得到了其可溶性的C端胞质结构域片段(149位氨基酸到379位氨基酸),命名为STINGCTD。然后利用座滴法进行晶体普筛工作,最后在14.4%PEG3350,0.08M二甲砷酸钠(PH=6.5)和0.16M氯化钙和20%(v/v)甘油条件下长出了晶体。由于坐滴法普筛中得到的晶体难以达到X-射线衍射及结构解析的要求,因此我们用悬滴法对STINGCTD蛋白进行了晶体的优化工作。主要通过以下几个方面：一是将晶体生长条件中的缓冲液PH和沉淀剂浓度在上述条件附近进行拉梯度；二是在晶体生长缓冲液中加入不同种类的additive和detergent;三是降低晶体生长的温度,在4度下进行晶体的优化培养：四是将晶体进行乙酸锂脱水处理。最终我们获得了适合x-射线晶体衍射并具有较高衍射分辨率的单晶,并在上海同步辐射中心收到了一套2.2A的衍射数据。初步处理结果表明STINGCTD的晶体属C222空间群,每个非对称单位中含有一个STINGCTD蛋白分子,陔分子与另一对称相关的分子形成一同源二聚体。由于STING蛋白在PDB数据库中没有具有较高同源性的蛋白质结构(大于30%),因此我们考虑用STING蛋白的硒代衍生物来解决晶体结构解析中的相位求解问题。我们在native蛋白普筛长出晶体的条件中直接进行硒代衍生物晶体的优化培养,最终通过利用native蛋白的晶体进行种晶(seeding)的方法获得STlNGCT硒代衍生物的单晶,并在上海同步辐射中心收到了一套2.70A的数据SeMet-STINGCTD的晶体属P2空间群,每个非对称单位也仅含有一个SeMet-STINGCTD蛋白分子，该分子与另一对称相关的分子形成同源二聚体， 利用单波长反常散射发(SAD)法解析的apo-STINGCTD结构中，STINGCTD以对称二体的形式存在，以V型结构存在，文献中预测的第五段长α螺旋其实并不是跨膜列，而是作为STING(?)包质结构域的组成部分参与二聚体相互作用界面的形成，并在二聚体内部参与形成疏水核心，该结构是一种全新的折叠形式 由于解析的apo-STINGCTD结构中，STINGCD以同源二聚体(dimer)的形式存在。为了验证STINGCTD二聚体的形成并不是晶体堆积所造成的一种人为结果，因此我们利用凝胶过滤层析法对STINGCTD蛋白在没有和加入c-di-CMP的情况下的分子大小。结果表明，STING蛋白大溶液中是以同源二聚体的形式存在，并且不受e-di-GMP的调控。另外，我们利用等温滴定量热法检测了STINGCTD与c-di-GMP的亲和力，其解离常数Kd值为3.70uM,复合物中STINGCTD与c-di-CMP(?)的化学计量数之比为2：1，即一分子的c-di-GMI结合两分子的STINGCTD,这与之前的研究结果相一致。 为了阐述STINGCTD识c-di-GMP的分子机制，我们对STINGCTD与c-di-GMP的复合物进行了晶体的优化培养，并最终收到了一套2.40A的数据，通过对衍射数据的初步分析，我们发现，c-di-GMP结合的STINGCTD复合物晶体属P212121空间群，相非对称单位中含有两个STINGCTD分子与一个cdi-GMP分子。