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薯蓣皂苷元对Ad-TSHR-289诱导Graves病模型小鼠甲状腺细胞增殖及免疫功能的影响

蔡鹄  
【摘要】:研究背景: Graves病(Graves' disease, GD)是一种伴随甲状腺激素分泌增多的自身免疫性甲状腺疾病,甲状腺肿大、高代谢症候群和Graves眼病是其典型的临床特点。GD患者体内免疫功能紊乱,存在异常增高的TSH受体抗体(TRAb), TRAb是一组淋巴细胞分泌的多克隆抗体,可与TSH受体不同位点结合,当TRAb中兴奋性抗体(TSAb)与甲状腺细胞TSH受体结合时,激活腺苷酸环化酶信号系统,导致甲状腺细胞过度增生和甲状腺激素合成分泌增加,从而引起甲状腺肿大和甲状腺功能亢进。 GD疾病过程中“甲状腺细胞过度增生”与细胞增殖机制异常相关。近年来研究表明除了TRAb外,其它细胞增殖相关分子(IGF-1、NF-κB、cyclin D1、 PCNA)在GD甲状腺肿大过程中起着重要作用。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种在细胞生长和增殖中发挥重要作用的多肽。我们前期研究现IGF-1通过真核细胞转录因子(NF-κB)通路,上调cyclin D1的表达,促进大鼠甲状腺细胞增殖。NF-κB是一种细胞转录因子,参与多种基因的转录调控,调控细胞增殖、细胞分化等过程。Cyclin Dl是一种重要的细胞周期蛋白,调控细胞周期从期G1进入S期。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,参与细胞周期S期DNA合成。 “免疫紊乱”是GD的诱发因素。近年来研究来表明GD患者存在T(淋巴)细胞亚群的异常,抑制性T细胞(Ts)功能缺陷,辅助性T细胞(Th)不适当致敏,使B(淋巴)细胞产生TRAb。T细胞根据细胞膜表面CD分子划分成不同的亚群。CD3分子仅存在于T细胞表面,因此主要用于标记成熟的T细胞。成熟的T细胞按照其表面CD分子的不同,又可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞主要是Th; CD8+T细胞主要是Ts和细胞毒性T细胞(CTL);两者的比值CD4+/CD8+反映体内免疫功能状态。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)是体内一类表型特征均为CD4+CD25+Foxp3+T细胞,它能够分泌IL-10和TGF-β,对T、B细胞具有抑制作用。近年来研究发现调节T细胞在GD的发生发展中起着重要作用。 在过去的20年中,抗甲状腺药物(例如他巴唑、丙硫氧嘧啶、甲亢平)是非难治疗性GD病最常见的治疗方式,存在高复发率、治疗周期长、对巨大甲状腺肿疗效不明显的缺点。目前临床上对GD发病过程中关键环节“甲状腺细胞增殖”和“免疫紊乱”,缺乏针对性的药物。 薯蓣皂苷元(Diosgenin, Dio),是一种天然来源的甾体皂苷元,以皂苷的形式主要存在于中药穿龙薯蓣的根茎中。在过去的三十年中,Dio被用于治疗或预防多种疾病,例如肿瘤、糖尿病、肥胖、血脂异常等。Moalic等报道Dio具有在体内外抑制多种实体肿瘤及白血病细胞系生长的作用,这种抗肿瘤的机制涉及到对增殖、凋亡、脂代谢及COX/LOX通路等的调节。Dio是合成各种甾体类药物的前体化合物,作为一种类固醇,其对免疫功能具有广泛的作用,具有促进TNF-α分泌,抑制IgE产生,上调调节性T细胞等作用。在传统中医民间验方的应用中,穿龙薯蓣被用于甲状腺瘤和甲状腺功能亢进的治疗。有中医药研究者报道穿龙薯蓣对免疫性大鼠甲状腺肿大有治疗作用。在前期的研究中我们报道了Dio能够引起甲状腺细胞细胞周期G0/G1的阻滞,降低cyclin D1表达从而抑制IGF-1诱发的人甲状腺原代细胞增殖。上述研究发现,提示我们Dio可能是一种对GD有治疗作用的药物,特别是在抗增殖和调节免疫方面。 基于上述研究现状,在本研究中,我们应用了一个表达TSH受体A亚单位的重组腺病毒(Ad-TSHR-289)诱导的GD模型小鼠,该模型能非常有效地模拟人类GD病的发病过程。我们拟通过动物体内实验来研究Dio对GD的治疗作用。 目的: 1.评价Dio对Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠甲状腺肿大的治疗作用;从抑制细胞增殖的角度,初步探讨其分子生物机制。 2.研究Dio对Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠免疫功能的影响。 研究方法: 1.动物模型构建及药物干预 具体分组如下:正常对照组,正常小鼠高剂量Dio干预组(100mg·kg-1·day-1),阴性病毒对照组,GD模型组,GD模型低剂量Dio治疗组,GD模型高剂量Dio治疗组。应用重组腺病毒Ad-TSHR-289,肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠,每隔3周注射一次,共3次,制备GD动物模型。成模后的小鼠分别给予高、低剂量的Dio治疗。Dio治疗12和24天后,分两批次处死小鼠,留取血清、甲状腺、脾脏标本。 2.Dio治疗过程中毒副作用的初步评估 处死称量前体重,采用全自动生化分析仪检测血清中的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)。 3.Dio对GD模型小鼠甲状腺肿大治疗作用评价 采用放射免疫法和电化学发光法测TT4和TRAb变化;Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量甲状腺大小;HE染色及电子显微镜观察甲状腺组织及超微结构变化。 4.Dio抑制甲状腺细胞增殖相关机制研究 采用BrdU掺入实验检测小鼠甲状腺组织中增殖细胞的变化;免疫组化检测Dio干预后小鼠甲状腺组织中IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的变化;Real-time PCR检测Dio干预后小鼠甲状腺组织中IGF-1、cyclin D1、PCNAmRNA水平的变化。 5.Dio对免疫功能的影响 流式细胞仪检测Dio干预后小鼠脾细胞CD3、CD4、CD8、调节性T细胞的变化。 结果: 1.Dio对正常小鼠及GD模型小鼠的体重、AST、ALT、Cr均没有显著性影响。 2.TT4和TRAb的变化:与正常对照组相比,GD模型组出现明显的TT4和TRAb增高(P0.05);与GD模型组相比,24天高、低剂量Dio治疗能明显降低GD模型小鼠血清中增高的TT4水平(P0.01),这种降低存在剂量依赖性。24天的高、低剂量Dio治疗并不能降低GD模型小鼠增高的TRAb水平。 3.甲状腺大体照片观察,12或24天的Dio治疗能明显缓解GD模型小鼠的甲状腺肿大。Image Pro-Plus6.0图像分析软件进一步的测定甲状腺截面积(代表甲状腺大小)。与正常组相比,GD模型组甲状腺截面积明显增大(P0.01);与GD模型组相比,高、低剂量Dio治疗组甲状腺面积均明显缩小(P0.05),这种作用存在剂量依赖性。 4.HE染色发现,GD模型组甲状腺增生明显,滤泡上皮细胞成立方状或高柱状,排列紧密,增生向滤泡腔内形成乳头状突起,滤泡形态不规则,滤泡内胶质明显减少。GD模型Dio治疗组上述增生改变明显缓解。 5.电子显微镜结果示,GD模型组甲状腺细胞合成分泌功能活跃,电镜下线粒体增多,体积增大,形状不规则;粗面内质网发达,池扩张,与线粒体相互缠绕;核膜凹陷,形状不规则;胞质内见大量的内吞胶质滴。GD模型高剂量Dio治疗组甲状腺上述改变均得到缓解。 6.BrdU标记甲状腺增殖细胞结果示:与正常对照组组相比,GD模型组甲状腺内的增嫡细胞明显增多(P0.01)。与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗能明显减少GD模型甲状腺内的增殖细胞(P0.05)。 7.免疫组化结果示:与正常对照组相比,GD模型组甲状腺内IGF-1、 NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表达增加(P0.05);与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗组甲状腺内IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表达降低(P0.05),这种作用存在剂量依赖性。 8. Real-time PCR结果示,与正常对照组相比,GD模型组甲状腺内IGF-1、 cyclin D1、PCNA mRNA水平的表达增加(P0.01);与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗能明显降低GD模型小鼠甲状腺内IGF-1、cyclin D1、 PCNA mRNA水平的表达(P0.05),这种作用存在剂量依赖性。 9.流式细胞仪检测发现,Dio对小鼠脾细胞中淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、 CD8+、CD4+/CD8+)无明显影响作用。与正常对照组相比,GD模型组脾细胞中调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+T cells)百分率降低(P0.05);与GD模型组相比,GD模型高剂量Dio治疗组脾细胞中调节性T细胞百分率增加(P0.05)。 结论: 1.Dio具有缓解Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠甲状腺肿大的治疗作用;在治疗过程中未发现Dio对体重、肝肾功有明显的影响作用。 2.Dio缓解甲状腺肿大的作用机制与抑制甲状腺细胞增殖有关,并不依赖于TRAb,其中涉及到对增殖相关分子(IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA)表达的抑制。 3.Dio能够纠正Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠脾细胞中调节性T细胞下 降的异常。


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