收藏本站
《山东大学》 2015年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

ZHX2调控脂蛋白脂酶参与脂肪肝及肝细胞肝癌的作用及机制研究

马洪鑫  
【摘要】:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的肝脏肿瘤,也是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率在世界范围内分别位于第六位和第三位。越来越多的研究证实,非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是肝癌的独立危险因素,NAFLD甚至可以直接致癌而不经过肝硬化。NAFLD发病率在西方国家大约是20~30%,而在亚洲大约为5-18%,并且呈逐年上升趋势。鉴于NAFLD的高发病率及其与HCC发生的密切相关性,揭示NAFLD发生机制及其向HCC转变的可能机制,对于NAFLD及HCC的预防及治疗均具有重要意义。NAFLD发病机制复杂,其促癌机制尚不清楚。脂代谢异常介导的游离脂肪酸增多及肝细胞脂质沉积是NAFLD形成和发展的先决条件。脂代谢异常不仅诱发NAFLD,而且也是多种实体瘤的重要表型。除了对葡萄糖的利用加快之外,肝癌等多种肿瘤脂质代谢旺盛,表现出“生脂”表型或脂质水解增多、脂肪酸摄取活跃。随着肿瘤发病机制研究的深入,人们发现许多癌基因和抑癌基因参与代谢信号通路的调控。因此,癌基因、抑癌基因介导的代谢异常可能是NAFLD发生及进展为HCC的重要机制。ZHX2 (zinc fingers and homobox 2)属于ZHX家族。该家族包括三个具有高度同源性的成员ZHX1、ZHX2和ZHX3。ZHX2蛋白能通过其HD1结构域自身聚合形成同源二聚体,也可以与其同家族成员ZHX1或ZHX3以及转录因子NF-YA形成异源二聚体,发挥抑制转录的功能。文献及我们的前期研究显示,ZHX2调控甲胎蛋白(a fetal protein, AFP)、Glypican-3 (GPC3)等重要HCC标志物及细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin E表达,在肝癌中发挥抑癌基因作用。家族型高脂血症及动脉粥样硬化个体的遗传分析发现,ZHX2基因为高脂血症易感基因,且ZHX2转基因动物血脂水平显著升高,提示ZHX2与脂质代谢异常相关。然而,ZHX2如何调控脂代谢,其机制如何?ZHX2调控脂代谢是否参与NAFLD,进而通过调控脂代谢影响HCC发生,迄今尚未见报道。本课题拟深入研究ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝细胞肝癌发生中的作用及其分子机制,并对其在改善肿瘤化疗耐药性中的作用进行探讨。第一部分ZHX2调控脂蛋白脂酶参与脂肪肝及肝细胞肝癌的作用及机制机体脂质代谢复杂,涉及脂肪酸摄取、脂蛋白水解转运、脂质合成、脂质氧化及再利用等多个过程。相关研究提示ZHX2与血浆脂质代谢异常相关。本实验室前期芯片结果显示ZHX2表达与一系列脂质代谢相关基因表达有相关性,脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase, LPL)就是其中之一。LPL是机体水解脂蛋白的关键酶,其生物学功能分为两部分:一部分为甘油三酯的水解酶作用,可将血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)所携带的甘油三酯水解,释放的游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)可被细胞直接摄取;另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁,可与脂蛋白残粒附着、结合,介导细胞对脂蛋白残粒的摄取。越来越多的研究显示,LPL在乳腺癌、脂肪肉瘤等多种实体瘤中高表达,并与这些肿瘤的预后差相关,提示LPL参与肿瘤发生。然而,LPL是否参与ZHX2介导的脂代谢调控及ZHX2介导的肿瘤抑制作用,迄今尚不清楚。本课题拟从ZHX2对LPL的调控作用,探讨ZHX2调控脂代谢及其在NAFLD和HCC中的作用及机制。一、ZHX2在多种肝癌细胞系中显著抑制LPL表达为明确ZHX2对LPL表达的调控作用,分别进行ZHX2过表达及siRNA干扰实验。利用脂质体在ZHX2本底表达低的细胞系HepG2、BEL7402、HEK293中转染ZHX2过表达质粒pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0空载体为对照;在ZHX2本底表达高的细胞系SMMC7721、QSG7701细胞系中转染ZHX2siRNA, negtive control为对照。Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)和Western Blot (WB)检测结果显示,ZHX2过表达能够明显抑制不同细胞内LPL的表达,而干扰ZHX2, LPL表达显著上调。以上结果说明ZHX2抑制LPL的表达。二、ZHX2通过Octamer位点负性调控LPL启动-子活性1.ZHX2显著抑制LPL启动子活性首先构建LPL全长启动子报告质粒pGL3-LPLp (-1678~+67),分别与ZHX2过表达载体共转染HepG2细胞和CHO细胞,与ZHX2 siRNA共转染SMMC7721、QSG7701细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示,ZHX2过表达能明显抑制LPL启动子活性,而干扰ZHX2表达,LPL启动子活性显著升高。将不同剂量的ZHX2表达质粒与相同剂量的LPL启动子报告质粒共转染HepG2细胞,双荧光素酶报告检测结果显示,ZHX2对LPL启动子活性的抑制作用呈剂量依赖性。2.转录起始点上游-96~-38nt是ZHX2抑制LPL启动子的关键片段为寻找ZHX2调控LPL启动子活性的关键位点,利用转录因子预测软件TFSEARCH分析LPL启动子中的转录因子位点,据此构建LPL系列截短启动子报告质粒(上游分别为-981、-816、-666、-430、-196、-96、-38,下游均为+67)。将这些报告质粒与ZHX2过表达载体共转染SMMC7721细胞系,检测启动子活性。结果显示,直到截短至-96-+67片段,ZHX2对其活性仍有很好的抑制作用,而只有启动子片段-38-+67不受ZHX2的影响。说明ZHX2在LPL启动子上的作用位点位于-96--38之间。3.ZHX2通过Octamer抑制LPL启动子活性根据转录因子结合位点的分布,重新构建截短启动子-52~+67,共转染实验显示ZHX2仍旧对其活性有很好的抑制作用。TFSEARCH软件分析显示,LPL启动子-52~-38之间的重要的转录因子结合位点只有一个,即Octamer。为验证其作用,设计突变引物,利用突变试剂盒将该区域的Octamer位点进行突变,并构建报告质粒pGL3-LPLp-96-Octamer-mutant。共转染及双荧光素酶报告基因检测结果显示,突变LPL启动子-52--38间的Octamer位点,ZHX2对LPL启动子活性的抑制作用消失,提示该区域Octamer位点是ZHX2调控LPL启动子活性的关键位点。为了进一步证实以上结果,将含有野生型及突变的Octamer片段的LPL启动子区-46~-39片段克隆至pGL3-promoter载体。共转染及双荧光素酶报告基因检测结果显示ZHX2能够抑制含有野生型Octamer片段的启动子活性,而不能抑制Octamer位点突变的启动子活性。转录因子软件TFSEARCH预测显示与Octamer位点相邻的-70~-65区域存在NF-YA的结合位点CCAAT。NF-YA是重要的LPL转录调控因子,且ZHX2能够与NF-Y A结合发挥转录抑制作用。为研究NF-YA在ZHX2介导的LPL转录调控中的作用,将NF-YA siRNA与pcDNA3.0-ZHX2-HA及LPL启动子报告质粒共转染HepG2田胞。结果显示,干扰NF-YA表达不影响ZHX2对LPL启动子的抑制作用,提示NF-YA不参与ZHX2介导的LPL启动子活性调控。4. EMSA及ChIP实验显示ZHX2能与LPL启动子Octamer位点结合为研究ZHX2与LPL启动子能否结合,将pcDNA3.0-ZHX2-HA转染HepG2细胞,提取核蛋白,进行染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)。对 HA抗体免疫沉淀后的DNA进行PCR扩增,结果显示,ZHX2能够与含有 Octamer的LPL启动子-96~+67片段结合,但不能与不含有Octamer的-177--67片段结合。为进一步研究ZHX2与Octamer的结合,分别用pcDNA3.0 及 pcDNA3.0-ZHX2-HA转染HEK293细胞,提取胞核蛋白。根据LPL启动子序列设计合成Octamer探针,凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)结果显示,含ZHX2的核蛋白能与标记探针很好的结合,该结合能被未标记探针竞争性抑制,加入HA抗体的super shift实验进一步验证了ZHX2蛋白能与Octamer序列的特异性结合。5. Co-IP实验显示ZHX2可以与转录因子Oct-1结合ZHX2含有与蛋白相互作用的HD1功能域。为研究ZHX2能否跟与Octamer结合的转录因子Oct-1结合,用pcDNA3.0-ZHX2-HA转染HepG2细胞后,提取细胞总蛋白,进行免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)实验。结果显示,IP抗体ZHX2杂交的蛋白能够与Oct-1结合,说明ZHX2能够与转录因子Oct-1相互结合。三、ZHX2通过抑制LPL减轻肝癌细胞系及小鼠肝脏的脂肪变LPL是机体水解脂蛋白的限速酶,并介导肝细胞摄取脂蛋白,在多种脂代谢相关疾病中发挥重要作用。ZHX2对LPL的调控作用提示ZHX2参与脂代谢相关疾病,为验证该假说,进行如下实验:1.ZHX2通过抑制LPL,减轻脂肪乳诱导的HepG2细胞脂肪变(1)脂肪乳诱导HepG2细胞脂肪变模型中ZHX2与LPL表达负相关首先检测不同浓度脂肪乳对细胞活力的影响,用不含游离脂肪酸的但含不同浓度(0.2%、0.4%、0.8%、1%、2%)脂肪乳的1%BSA培养基分别培养HepG2细胞,用CCK-8法检测细胞活力。结果发现72h内,0.4%及更小浓度的脂肪乳不会影响HepG2细胞活力。用不同浓度的脂肪乳(0.2%、0.4%、1%)诱导HepG2细胞脂肪变,检测细胞中ZHX2和LPL的表达变化与脂肪变程度的关系。结果发现,随着脂肪乳浓度的升高,细胞脂肪变程度增强,细胞内ZHX2表达降低而LPL的表达升高。(2)ZHX2抑制脂肪乳诱导的HepG2细胞脂肪沉积,LPL过表达逆转上述过程将pEGFP-N1-ZHX2转染HepG2细胞,24h后加入0.4%脂肪乳。24h后,油红O染色显示脂质沉积,DAPI染核。镜下观察,结果显示,EGFP-ZHX2阳性细胞脂质沉积明显少于周围细胞。提示,ZHX2抑制肝细胞脂肪沉积。为研究LPL在ZHX2抑制肝细胞脂肪变中的作用,构建LPL过表达载体 pcDNA3.0-LPL-HA。将不同剂量的LPL过表达载体与ZHX2过表达载体共转染HepG2细胞,然后用0.4%脂肪乳诱导脂肪变。48h后,超声裂解细胞,化学发光法检测细胞裂解液中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。结果发现LPL能够明显促进细胞的脂质沉积,且共表达LPL和ZHX2的细胞,脂肪变的程度明显比ZHX2单独转染组细胞脂质沉积多。说明LPL参与ZHX2抑制HepG2细胞脂肪变过程。2.ZHX2通过负调控LPL表达抑制小鼠肝脏脂肪变(1)脂肪肝小鼠模型肝组织中ZHX2表达显著降低为进一步研究ZHX2及LPL在脂肪肝中的可能作用,分别利用胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient,MCD)饮食及高脂饮食(High-fat diet,HFD)诱导小鼠脂肪肝模型。抽提肝组织RNA,RT-PCR检测Afrl(小鼠ZHX2)及LPL的表达。结果显示,不论是哪种方式诱导的小鼠肝脏脂肪变,其肝内Afrl的表达均明显低于正常饮食组,相应的LPL的表达均高于正常饮食组。提示,ZHX2调控LPL参与肝脏脂肪变。(2)干扰ZHX2促进小鼠肝脏脂肪变为验证ZHX2在体内参与肝脏脂肪变的作用,构建针对Afrl的小干扰慢病毒Lenti-Virus-Afrl-shRNA,以每只小鼠3x10^7 TU慢病毒,10%体重(m1)的量,尾静脉高压注射C57BL/6小鼠,一周后MCD饲喂。每周称体重,两周后处死小鼠,称肝重,肝脏大体拍照,肝匀浆液测TG。肝冰冻切片油红O检测脂质沉积,并用IPP6.0分析脂质沉积面积。肝石蜡切片做HE染色,观察肝损伤。结果显示,MCD成功诱导肝脏脂肪变,且干扰Afr1表达显著加重MCD诱导的肝脏脂肪变。(3)过表达LPL逆转ZHX2对MCD诱导小鼠脂肪肝的抑制作用为进一步体内验证LPL在ZHX2抑制肝脂肪变中的作用,尾静脉高压注射法分别将ZHX2过表达质粒、LPL过表达质粒单独或联合注入小鼠体内,每只小鼠60μg质粒,注射体积同上。注射后2天进行MCD饮食。每隔5天补注射一次质粒。2周后处死小鼠,处理同上。结果显示ZHX2过表达组脂肪变程度最轻,LPL过表达组最重,ZHX2与LPL联合组介于两者之间,即过表达LPL能显著逆转ZHX2对肝脂肪变的保护作用。说明LPL参与ZHX2抑制小鼠脂肪肝发生。四、ZHX2通过下调LPL表达抑制肝癌细胞体内外生长文献报道乳腺癌、脂肪肉瘤组织中LPL表达显著增加,并促进乳腺癌细胞生长。为研究LPL在ZHX2抑制HCC生长中的作用,进行如下实验:1.肝癌患者癌组织LPL表达明显高于癌旁组织,且ZHX2与LPL表达显著负相关收集22例肝细胞肝癌及其对应的癌旁组织标本,提取RNA并逆转录。实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, Q-PCR)检测LPL表达量。结果显示HCC组织的LPL表达量明显高于癌旁(p0.05)为了进一步证实上述结果,购买HCC组织芯片(含有75例患者癌和癌旁组织切片)。免疫组化结果显示,癌组织LPL染色明显强于癌旁组织。对染色结果进行评分,统计学分析显示,LPL在癌组织中的表达明显高于癌旁组织(p0.05)。为了验证HCC标本中ZHX2对LPL表达的调控作用,选取肝癌临床标本及组织芯片标本连续切片共97例,分别进行ZHX2和LPL免疫组化染色。结果显示:ZHX2表达与LPL表达存在明显的负相关关系(p0.05),即LPL在高表达ZHX2的HCC中的表达显著低于低表达ZHX2的HCC。2.LPL以脂质依赖性方式显著促进HepG2肝癌细胞系的生长免疫组织化学染色结果显示HCC组织中LPL异常高表达,并与抑癌基因ZHX2显著负相关,提示LPL参与HCC发生发展。为研究LPL对HCC生长的作用,用LPL过表达载体分别转染HepG2、SMMC7721、QSG7701细胞后,CCK-8法检测细胞生长。结果发现,在含10%FCS的正常培养基培养情况下,LPL明显促进HCC细胞生长。医用注射用脂肪乳类似于乳糜微粒,是医院病房常备药。此前,本课题用较高浓度(0.4%)脂肪乳诱导HepG2脂肪变。本实验设浓度梯度(0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、1%、2%)脂肪乳,培养72h。细胞活性检测发现,0.1%脂肪乳不仅不对肝细胞造成损伤,反而能够补足1%BSA因为脂蛋白缺乏造成的细胞生长减缓。为验证脂蛋白对LPL促细胞生长作用的影响,分别在含10%小牛血清(Fetal calf serum, FCS)完全培养基、含1%BSA的培养基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培养基中继续培养,CCK-8检测细胞活力。结果显示,完全培养基中LPL能够明显促进细胞生长。当使用含1%BSA的培养基代替含10%FCS的正常培养基后,因为脂蛋白和游离脂肪酸的缺乏,细胞生长明显减慢,且LPL的促生长作用消失。3.LPL明显改善ZHX2对肝癌细胞的生长抑制作用,该作用依赖于脂质的存在为研究LPL在ZHX2抑制肝癌细胞生长中的作用,将LPL过表达质粒与ZHX2过表达质粒共转染HepG2细胞后,分别在含1 0%FCS完全培养基、仅含1%BSA的培养基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培养基中继续培养,CCK-8检测细胞活力。结果显示,完全培养基中LPL过表达显著破坏ZHX2对HepG2细胞生长的抑制作用,而撤除脂质(1%BSA培养基),该作用消失,添加0.1%脂肪乳后LPL对ZHX2抑癌作用的逆转作用恢复。4.LPL能够逆转ZHX2对荷瘤小鼠体内H22肝癌细胞生长的抑制作用为验证LPL体内逆转ZHX2抑制肝癌细胞生长的作用,取腹腔活化的腹水瘤H22细胞2x10∧7/ml,按照100ul/只小鼠,皮下注射建立荷瘤小鼠。3天后,瘤径约3-5mm时,按照20μg/100μl量,瘤内注射质粒:pcDNA3.0, pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0-LPL-HA, pcZHX2+pcLPL。每隔两天测瘤径及瘤内注射质粒。15天后,杀鼠取瘤,称瘤重,拍照。结果显示,LPL过表达显著促进荷瘤鼠体内肝癌细胞生长,且LPL过表达有效逆转ZHX2对荷瘤鼠体内HCC的抑制作用。综上,本研究通过一系列体内外实验及临床标本检测,首次阐明ZHX2对LPL转录负调控的分子机制并首次报道LPL在HCC癌组织的异常高表达及其促HCC生长作用。研究表明ZHX2作为一种转录抑制因子,除了已知的对癌基因和周期蛋白的抑制之外,还可通过对脂代谢重要酶LPL的转录抑制,从而抑制肝细胞脂肪沉积,延缓脂肪肝的发生,并通过抑制LPL介导的脂肪摄取及累积抑制HCC生长。第二部分ZHX2通过下调MDR1增强肿瘤细胞的化疗敏感性肿瘤细胞内脂代谢异常活跃,大量合成或摄取的脂肪酸一方面为肿瘤细胞生长供能,一方面形成肿瘤细胞中富含饱和脂肪酸的生物膜系统,使肿瘤细胞更能耐受射线损伤及药物的毒性作用,成为肿瘤耐药的机制之一。临床研究发现,骨髓瘤患者ZHX2表达与患者的药物耐受性显著相关,提示ZHX2在肿瘤耐药中发挥重要作用。P蛋白(又称为肿瘤多药耐药蛋白1, Multidrug resistance 1, MDR1)不仅能够将化疗药物泵出细胞外,导致多种肿瘤耐药,还能将饮食来源的胆固醇泵入胞内。其启动子区存在NF-Y结合位点,并且NF-YA能够正调控MDR1启动子活性。本课题设计实验研究ZHX2能否通过对MDR1的调控达到改善HCC及肺癌细胞化疗敏感性的效果。一、ZHX2显著增强不同肿瘤细胞的化疗敏感性1.ZHX2表达水平与肿瘤细胞化疗敏感性相关本实验首先用肝癌细胞系和肺癌细胞系同时验证化疗药物顺铂(CDDP)对细胞的毒性。结果显示,ZHX2内源性表达高的细胞系(SMMC7721, A549), CDDP对细胞的抑制率高,提示ZHX2可能会影响肿瘤细胞的化疗敏感性。2.ZHX2增强肝癌及肺癌细胞系对顺铂及阿霉素的敏感性将不同的细胞系分别转染ZHX2的过表达质粒和siR,NA后,加入不同浓度的CDDP和阿霉素(ADM),24h后,CCK-8检测细胞存活率,并计算半数抑制浓度IC50值。结果显示:ZHX2过表达组IC50值显著低于pcDNA3.0对照组;而相对阴性对照(Negative control,NC)组,ZHX2 siRNA组(ZHX2-1674,ZHX2-2360)IC50值均明显升高。上述结果显示,ZHX2可以改善肿瘤细胞对CDDP.ADM的耐药性。3.ZHX2促进CDDP介导的肿瘤细胞凋亡为了进一步验证上述结果,选取耐药性较高的细胞系HepG2,过表达ZHX2后,用CDDP(20ug/ml,24h)诱导细胞凋亡。用AnnexinV-PI标记凋亡细胞,流式检测各组细胞凋亡情况。结果显示,ZHX2联合CDDP组细胞早期凋亡最多,说明ZHX2能够增强化疗药物CDDP对HepG2细胞的损伤。二、ZHX2负向调控不同肿瘤细胞系中MDRl表达MDR1是与肿瘤多药耐药性密切相关的基因,且其启动子区NF-Y结合位点的存在提示我们此基因极有可能也被ZHX2所调控。为了验证ZHX2对MDR1表达的抑制作用,分别将ZHX2过表达载体和ZHX2 siRNAs转染入不同细胞系。RT-PCR及WB结果显示,ZHX2过表达明显抑制肝癌及肺癌细胞系中MDR1表达;而用ZHX2 siRNAs干扰ZHX2,不同肿瘤细胞中MDR1的表达均明显上调。三、ZHX2显著抑制不同肿瘤细胞中的MDR1药物泵功能MDRl又被称为P蛋白,可以以ATP依赖性方式将包括化疗药物在内的多种物质选择性泵出细胞外。为验证ZHX2对MDR1药物泵的抑制作用,分别将pEGFP-N1-ZHX2转染HepG2和SPC-A-1细胞,24h后,加入40μg/ml ADM.作用4h后,DAPI染核。镜下观察,发现ZHX2阳性细胞内ADM含量明显高于周围其他细胞。将pEGFP-N1-ZHX2转染HepG2,24h后,加入40μg/ml ADM。一组细胞继续培养2h,待检测药物富集;另一组细胞换成不含ADM培养基,继续培养2h,待检测药物潴留,最后计算药物释放指数。流式结果显示,EGFP阳性细胞群ADM富集多,潴留多,释放少。上述实验结果显示,ZHX2可以显著抑制药物外流从而增加细胞内药物浓度。四、ZHX2通过影响NF-YA与MDR1启动子相应元件结合抑制MDR1转录1.ZHX2剂量依赖性抑制MDR1启动子活性ZHX2具有转录抑制活性。为研究ZHX2对MDR1启动子活性的抑制作用,分别将ZHX2过表达载体或ZHX2 siRNAs与MDR1启动子报告基因质粒共转染不同的肿瘤细胞系。双荧光素酶报告基因检测显示,增强ZHX2表达能显著抑制MDR1启动子活性,而干扰ZHX2能显著增强MDR1启动子活性,且均呈剂量依赖性。2.ZHX2以NF-YA依赖性方式抑制MDR1转录活性在MDR1野生型启动子报告质粒pGL3-Mp的基础上,构建ATTGG元件突变的MDR1启动子载体pGL3-mMp,并将这两种载体分别与ZHX2过表达载体或pcDNA3.0共转染HepG2细胞,检测ZHX2对启动子活性的影响。双荧光素酶报告基因检测结果显示,NF-YA结合位点突变后,ZHX2对启动子活性的抑制作用消失。与此相一致,将NF-YA siRNA、ZHX2过表达质粒及MDR1启动子报告质粒共转染HepG2细胞,发现干扰NF-YA表达后ZHX2对MDR1启动子的抑制作用消失。3.免疫共沉淀实验证实,肿瘤细胞中ZHX2能与NF-YA结合为了确认ZHX2与NF-YA的相互作用,将ZHX2过表达载体转染HepG2细胞。48小时后裂解细胞,用NF-YA抗体及同型对照IgG作为IP抗体。免疫沉淀后的蛋白,用ZHX2抗体和NF-YA抗体进行WB。结果显示与NF-YA抗体结合的蛋白也能与ZHX2抗体结合,即ZHX2与NF-YA结合。4.ZHX2干扰NF-YA与MDR1启动子的结合为进一步研究ZHX2对MDR1的转录调控机制,分别在HepG2细胞和SPC-A-1细胞中过表达ZHX2,将ZHX2过表达蛋白分别与NF-YA 、 HA抗体孵育,按照前面的方法进行ChIP实验。结果证实ZHX2及NF-YA均能与MDR1启动子区相结合,且ZHX2过表达明显减弱NF-YA与MDR1启动子区的结合。EMSA实验进一步证实,含CCAAT原件的探针能够与过表达ZHX2的HepG2细胞核蛋白结合。上述结果提示,ZHX2通过与NF-YA相互竞争CCAAT位点而抑制MDR1启动子活性。五、肿瘤组织标本检测显示耐药基因MDRl与ZHX2表达存在负相关关系为在临床标本中验证ZHX2对MDR1的调控作用,收集30例HCC临床标本和54例肺癌(其中肺鳞癌33例,肺腺癌21例)临床标本,免疫组化检测ZHX2和MDR1表达,评分后统计学分析其相关性。结果显示,无论是肝癌组织还是肺癌组织,ZHX2表达均与MDR1表达显著负相关(肝癌,p0.05;肺癌,p0.001),即MDR1低表达肿瘤组织中ZHX2表达量明显高于MDR1高表达组(肝癌,p0.05;肺癌,p0.01)。综上所述,ZHX2可通过转录负调控MDR1,降低肝癌及肺癌的多药耐药性。ZHX2调控MDR1可能的分子机制是通过与NF-YA相互竞争CCAAT位点而导致MDR1启动子活性的降低。本研究提示ZHX2可增强肿瘤的化疗敏感性,为肿瘤的基因治疗又添有力证据。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R575.5;R735.7

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 David Yiu-Kuen But;Ching-Lung Lai;Man-Fung Yuen;;Natural history of hepatitis-related hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年11期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;JNK1,JNK2,and JNK3 are involved in P-glycoprotein-mediated multidrug resistance of hepatocellular carcinoma cells[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年03期
2 单艳平;高旭东;白文林;曾珍;楼敏;杨永平;;氩氦刀冷冻消融术治疗原发性肝癌发热原因分析[J];传染病信息;2012年05期
3 张岩岩;张琦;李云芳;李宏军;;HBV相关肝硬化结节多步演变MR影像特征研究现状及最新进展[J];磁共振成像;2014年03期
4 Hong Zang;Dong Ji;Qing Shao;Guang-de Zhou;Deng Pan;Shao-jie Xin;Jing-min Zhao;Guo-feng Chen;;Association of the Cellular Apoptosis Susceptibility Protein with HBV Infection in Hepatocellular Carcinoma[J];Infection International(Electronic Edition);2014年02期
5 陈竹;王丽;曾义岚;刘大凤;兰丽娟;唐玉珍;朱丽;李守娟;;慢性乙肝患者的免疫状态与病毒载量及抗病毒疗效的关系研究[J];成都医学院学报;2015年04期
6 任崧;叶兆祥;朱理珉;;肝硬化结节多步癌变的病理及影像学表现[J];临床肝胆病杂志;2011年04期
7 杨小蓉;刁蔚欣;冯红梅;卢景辉;;基因HLA-DR13表达及BCP突变与HBV感染后临床转归的相关性研究[J];免疫学杂志;2014年10期
8 白文林;高旭东;何艳;楼敏;曾珍;王春平;陆荫英;杨永平;;氩氦刀治疗肝癌术后并发感染21例分析[J];人民军医;2013年04期
9 臧彩红;张艳;江金花;王宁;韩立;马方;王庆端;;盐酸千金藤碱逆转肝癌多药耐药性与P-gpATP酶活性的关系研究[J];中国药理学通报;2011年07期
10 张艳;韩鹏黎;徐霞;程旭芳;王宁;戈士文;;新型金属铜络合物对SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响[J];中国药理学通报;2012年03期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 曹峻;真菌松茸提取物在HBV转基因小鼠癌变中化学预防作用的初步评价[D];新疆医科大学;2010年
2 杨富;慢性乙型肝炎相关肝癌发生、发展过程中的表观遗传学机制研究[D];第二军医大学;2011年
3 高姗;上海市区原发性肝癌的流行病学研究[D];复旦大学;2011年
4 王刚;microRNA-122调控的自杀基因治疗肝癌的研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年
5 阿斯玛·萨利姆·卡兹;不同淋巴道转移相关蛋白亚细胞组分表达与淋巴道转移相关性的比较分析[D];大连医科大学;2011年
6 黄春梅;HBV感染巨噬细胞的可能途径及HBx诱导Grp78与MHC-Ⅰ类分子表达的研究[D];华中科技大学;2012年
7 周晓晶;以CpG ODN为佐剂的肝癌相关抗原对小鼠肝癌抑制作用研究[D];吉林大学;2012年
8 魏俊妮;胎盘细胞凋亡在HBsAg阳性孕妇PBMC母—胎转运机制中的作用[D];山西医科大学;2012年
9 刘寒强;基于RNA-seq技术的肝细胞肝癌转录组学研究[D];第四军医大学;2011年
10 李元元;乙肝相关性肝癌的危险因素及其与淋巴细胞亚群关系的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 崔剑雄;CT、MRI测量原发性肝癌大小准确性研究[D];河北医科大学;2011年
2 喻垚;HBx稳定细胞株L02与HepG2的构建及其对GSK3β表达的影响[D];重庆医科大学;2011年
3 王卫兵;酒精对乙肝病毒相关性肝癌的影响[D];浙江大学;2011年
4 臧彩红;盐酸千金藤碱(CH)逆转肝癌多药耐药性与P-gp ATP酶活性的关系研究[D];郑州大学;2011年
5 范春光;miR-122调控靶基因NDRG3在HBV相关肝癌中的作用研究[D];山东大学;2011年
6 周倜;门静脉高压脾功能亢进大鼠肝癌发生的实验研究[D];第四军医大学;2011年
7 曹晨;Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用[D];大连医科大学;2011年
8 吕慧丽;葛根粗提物及葛根素对人肝癌SMMC-7721细胞的作用及机制[D];郑州大学;2009年
9 常秀娟;肝细胞癌MACC1/HGF/c-Met的表达及临床研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
10 韩鹏黎;金属铜络合物对肝癌SMMC-7721细胞的作用及其机制研究[D];郑州大学;2012年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 赵慧,郑文岭,崔东,马文丽;泛素启动子的研究进展[J];广东医学;2003年12期
2 高刚;鲁艳芹;韩金祥;赵丽;;双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响[J];中国生物制品学杂志;2009年10期
3 程元桥,林菊生,王文琦,廖家智,姜晓丹,冯玮,熊平;诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能[J];世界华人消化杂志;2004年09期
4 吴志香;邵敬伟;袁凤山;;胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子的克隆与序列分析[J];生物技术通讯;2005年06期
5 王秀亮;陈卫;梁光萍;陈建;苏踊跃;杨程;罗向东;;人β1整合素启动子核心启动序列初步分析[J];现代生物医学进展;2009年01期
6 周天鸿,李月琴,朱嘉明,云泓若,肖小敏;真核细胞转录系统启动T7启动子起始的研究[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2000年03期
7 朱立红;倪培华;应雅韵;张洁;金磊;樊绮诗;;血脂与肝脂酶启动子514C/T多态性的关系[J];诊断学理论与实践;2005年06期
8 朱爱华,彭大新,刘秀梵,张如宽;鸡痘病毒载体启动子的优化[J];病毒学报;2000年04期
9 丁清泉,戴顺英;σ~(38)识别的启动子-35区核酸序列特征研究[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年01期
10 黄小东,张俊武,阳学贤,王以弘,赵华路;人Aγ-珠蛋白基因-173T→C突变对启动子功能的影响[J];中国医学科学院学报;1999年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐昌杰;胡桂兵;张上隆;;果实成熟特异启动子研究进展[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
2 萧凤回;段承俐;薛刚平;;快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年
3 龙海涛;李洪清;李玲;;蓝猪儿捕获启动子系统建立[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年
4 杨俊;刘继红;郭小林;王涛;王军凯;陈美元;王少刚;叶章群;;人肾组织GGCX基因启动子区克隆与活性分析[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
5 马小娟;侯林;陈曦;马飞;;人类选择性剪接基因与选择性启动子关联的系统分析[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年
6 陈慧峰;林育纯;林丽娜;方飞;陈雯;林忠宁;;蛋白磷酸酶2A不同亚基基因启动子区遗传变异性位点筛查[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年
7 李静;刘学群;王春台;;一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达[A];湖北省植物生理学会第十五次学术研讨会论文集[C];2007年
8 吕杰;赵莹子;黄玉屏;沈萍;陈向东;;嗜盐古生菌Haloarcula hispanica淀粉酶基因启动子的研究及其跨域表达载体的构建[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
9 夏定国;张婷婷;赵巧玲;张国政;裘智勇;;家蚕脂肪酶Ⅰ基因的启动子分析[A];第十届家(柞)蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2013年
10 王小华;姜广水;吴钦贞;姜萍萍;刘浩;江浩;;二价双启动子防龋DNA疫苗的构建及鉴定[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 记者 钱铮;人类DNA上启动子数量可能超过十九万[N];人民日报;2006年
2 钱铮;人类DNA上启动子数量可能超过19万个[N];医药经济报;2006年
3 ;儿童系统性红斑狼疮中白细胞介素-10启动子区单核苷酸多态性对自身表达水平的影响[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马洪鑫;ZHX2调控脂蛋白脂酶参与脂肪肝及肝细胞肝癌的作用及机制研究[D];山东大学;2015年
2 宋剑平;基质金属蛋白酶-3基因启动子区多态与散发性脑动静脉畸形的遗传易感性分析与功能研究[D];复旦大学;2014年
3 杨予涛;一个光合组织特异表达启动子的克隆、功能分析及其转录因子的鉴定[D];山东农业大学;2005年
4 杨晓敏;环加氧酶-2启动子区抑制性结合蛋白的鉴定和功能分析[D];南京医科大学;2007年
5 柳小庆;玉米胚特异性高表达启动子的基因组规模筛选、克隆和功能鉴定[D];中国农业科学院;2014年
6 李哲;酿酒酵母和大肠杆菌的启动子特性及其代谢工程应用研究[D];北京理工大学;2015年
7 陆超;人CD2AP基因启动子的鉴定及其功能研究[D];南京医科大学;2010年
8 宋斐;胚乳特异性ALP type-B基因启动子的克隆及其功能分析[D];华中科技大学;2012年
9 姜安丽;人同源盒基因NKX3.1启动子的克隆及其调控区的鉴定[D];山东大学;2005年
10 岳扬波;AAV-2 P5启动子功能的分子基础研究[D];复旦大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 余霜;家蚕血细胞特异启动子的筛选与鉴定[D];西南大学;2015年
2 王璇;水曲柳节律基因LHY启动子克隆及功能研究[D];东北林业大学;2015年
3 赵夏云;芥菜开花整合子SOC1的启动子克隆及其与FLC、SVP蛋白相互作用[D];西南大学;2015年
4 张鑫平;拟南芥和油菜花药特异表达启动子的克隆与功能分析[D];华中农业大学;2015年
5 于璐;受体相互作用蛋白激酶3转录调节特性研究[D];苏州大学;2015年
6 李玉姣;猪肝脏特异性TTR基因启动子驱动扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因在转基因鼠中的表达验证[D];华中农业大学;2015年
7 郭凯庆;反向PCR精确定位人结肠癌SW480细胞CD133基因启动子区脱氧核糖核酸酶Ⅰ高敏感位点[D];山西医科大学;2015年
8 杨丹;大豆诱导型NAC转录因子基因启动子克隆及功能研究[D];山东大学;2015年
9 李杰;杨树木质部特异性启动子的功能及JCesAP关键调控域研究[D];河北农业大学;2015年
10 汪泽宇;c1orf109结合cyclin D1启动子序列特征研究[D];哈尔滨工业大学;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026