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《山东大学》 2014年
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调节性T细胞改善缺氧诱导的小鼠肺动脉高压的实验研究

褚衍彪  
【摘要】:1背景肺动脉高压(PAH)是一种严重威胁人类健康的疾病,它常伴有多种肺脏和心脏的疾病而导致发病率和死亡率增加,目前仍没有有效的治疗方法。PAH的发病机制十分复杂,目前我们仍不清其具体的发病机制。报道发现在PAH的发病过程中常常伴有血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及炎症细胞增生和聚集。血管平滑肌细胞(VSMC)具有多种细胞表型,存在于血管的中间层,正常情况下处于静息状态,以维持血管的紧张度。当处于病理条件下,有些VSMC就转变成“合成型”,分泌炎性细胞因子从而导致血管发生病理改变。当前认为,肺动脉进展性的重塑是造成肺动脉高压肺动脉难以治疗的主要原因,而VSMC的增生则是造成肺动脉重塑的一个重要因素。近年来,免疫机制在肺动脉高压的发病机制中受到越来越多的关注,但是免疫调节机制是如何促进肺动脉高压发病的机制仍不清楚。CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)是一组特殊的T细胞亚群,它的主要作用是调控免疫反应,控制免疫反应的进展,如果Tregs数量减少或功能异常则会导致免疫紊乱。Tregs已经被证实在很多疾病中具有有效的治疗效果,但是其在肺动脉高压的治疗作用仍不清楚。此研究主要就是研究Tregs是否能影响肺动脉高压发病并探讨其中的作用机制。2目的(1)在体内试验中,观察Tregs对小鼠肺动脉的炎症反应和血管重塑的影响;(2)在体外试验中,探讨Tregs抑制平滑肌细胞增生的机制。3方法3.1动物模型8周龄的60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为常氧组、对照组和Tregs组,每组20只。对照组和Tregs组在含氧的10%低氧箱中喂养,常氧组与对照组和Tregs组均在同一个房间中喂养4周。所有的小鼠食物和水源都是一致的,实验第4周后安乐处死。3.2分选和转移分离8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾细胞,利用磁珠分选技术获得纯化的TregS。纯化的Tregs按要求分别溶于200 u 1 CD4+CD25+ regulatory T PBS中。小鼠在放入低氧箱前一天,Tregs组小鼠通过小鼠尾静脉注入Tregs (106 cells),对照组小鼠注入PBS。3.3血流动力学检测将小鼠麻醉,仰卧位固定于手术台上,使用小鼠气管插管。使用26号测量管经剑突下途径经皮穿至胸腔,通过其末端链接的压力传感器测量并记录右心室收缩压(RVSP)数据。整个过程中,小鼠可自然呼吸,并且其心率均维持在300-600次/分。小鼠处死后,将小鼠左心室与室间隔作为一个整体与右心室剥离,并分别测量其质量,以计算Fulton's旨数。3.4体重及血脂实验的0周和4周末,分别测量每组小鼠的体重。4周末检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。3.5细胞培养利用磁珠分选将Tregs细胞从健康人群外周血单核细胞中游离。将人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)在含有小牛血清的DMEM培养液中传至第四代,放在低氧条件下培养(1% O2,5% CO2), 分为对照组和Tregs组。Tregs组加入Tregs (5 ×105/well)共培养,对照组不加入T细胞,二者均加入抗-CD3抗体(50ng/ml)在37°C培养48小时。3.6 hPASMC的增值测定使用MTT法测定hPASMCs增值。在96孔板中以每孔5000个细胞的密度种植,在放置缺氧条件前加入或不加入Tregs,在10 μL MTT (5mg/mL)/孔37℃条件下孵育4小时。去掉上清液后,加入DMSO75 μL/孔。使用全波长多功能扫描仪以570 nm波长分析样本。使用6孔板以相同的密度种植hPASMCs,并在上述条件下进行处理。使用结束时使用PBS冲洗,胰酶处理,使用血细胞计数器进行细胞计数。3.7 RT-PCR搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取RNA,测量肺Foxp3,MCP-1,IL-1β, IL-6, IL-10以及肺动脉平滑肌细胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK mRNA的表达。3.8 Western blot搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取蛋白,测量肺Foxp3, MCP-1, IL-1 β, IL-6, IL-10以及肺动脉平滑肌细胞cyclin Dl, CDK4, p27, Akt及ERK蛋白的表达。4结果4.1动物一般情况各组小鼠体重以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无显著统计学差异。4.2 Tregs增加了Foxp3的表达Foxp3在Tregs特异性的表达,是Tregs的分化成熟和起效的必要性的标志。此实验发现经小鼠尾静脉注入Tregs的小鼠肺脏中,Foxp3 mRNA的表达明显高于对照组。此结果证实外源性Tregs可以进入到小鼠的组织中。4.3 Tregs可降低缺氧诱导升高的肺动脉压和右心室的肥厚右心室收缩压(RVSP)与肺动脉压(PAP)有绝对的正向关系。相对于常氧组小鼠,低氧条件下小鼠的RVSP是升高的。使用Tregs处理的小鼠其RVSP明显降低。慢性缺氧可以导致右心室的肥厚,我们在这个研究中测量了Fulton's指数,结果显示缺氧条件下可伴有Fulton's指数的增加,而在Tregs组其Fulton's指数在部分程度上得以降低。此结果表明Tregs可以改善缺氧诱导的肺动脉压力和右心室肥厚。4.4 Tregs可以下调炎症因子的表达,上调抑炎因子的表达。在小鼠肺组织中,我们通过RT-PCR方法,发现Tregs组促炎性因子MCP-1,IL-1 β和IL-6的表达明显低于对照组。MCP-1, IL-1β和IL-6的蛋白表达水平也是相似的结果。此外我们也发现抗炎性介质IL-10在Tregs组明显高压对照组。这些结果表明Tregs可以降低促炎性细胞因子的表达而上调抗炎性细胞因子的表达。4.5 Tregs可减少缺氧造成的hPASMCs的增生。我们通过MTT方法发现相对于缺氧组,Tregs可以抑制HPASMCs的增生。细胞计数分析也得到了相似的结论。我们认为Tregs对HPASMC的抑制作用是减缓肺动脉高压进展的重要机制。4.6Tregs促使缺氧的hPASMCs停留在G1/G0期细胞的增值依赖于由G1/G0期转到G2/S期。此实验发现,通过Tregs处理的HPASMCs,与对照组相比,有更大比率的细胞处在G1/G0期。4.7 Tregs可减少cyclin D1和CDK4表达,增加p27的表达。cyclin D1, CDK4和p27在细胞增值及细胞周期中起到关键的作用。我们发现在体外实验的HPASMCs中,cyclin D1, CDK4的mRNA和其蛋白表达水平都较Tregs组的明显降低,而在Tregs处理的HPASMCs中,其p27的mRNA蛋白表达都明显高于对照组。这个结果表明Tregs通过调节细胞周期的方式是减缓肺动脉高压发病发展的另外一个机制。4.8 Tregs降低Akt和ERK1/2磷酸化水平。已经有报道,Akt和ERK是肺动脉平滑肌细胞增生的主要途径之一。我们通过western blo方法检测体外的HPASMCs表达的Akt和ERK蛋白水平。我们发现,相对于对照组,Tregs可以明显下调Akt和ERK蛋白的磷酸化水平。5结论(1) Tregs可以缓解缺氧诱导的肺动脉高压的形成;(2)其主要的机制是Tregs可以明显抑制炎症反应,增强抗炎性反应,调整细胞增值周期,抑制hPASMCs的增生;(3) Tregs可能成为治疗肺动脉高压的一个有效的方法。1背景:肺动脉高压(PA战不仅仅是一种疾病,而是一系列的疾病的统称,它严重威胁着人类健康,其发病机制仍不清楚。它共有的特征是复杂的血管内皮的增生和持续进展的肺血管的重塑,血管的平滑肌细胞增生在血管重塑过程中起到不可或缺的作用。缺氧性肺动脉高压是肺高压的一种重要的临床亚型,我们常见的慢性阻塞性肺疾病及肺间质纤维化常常伴有缺氧性肺动脉高压,其中有报道慢阻肺急性加重的病人中有91%伴有肺高压,它可进一步导致右屯、室肥厚甚至右也室衰减,这直接决定了病人的预后。目前对肺高压仍没有肯定的治疗方法。精氨酸酶(Argnase Arg)是作用于尿素循环的酶,可W将精氨酸转化成尿素和鸟氨酸,精氨酸酶2(Arg2)主要在肾脏、血管平滑肌细胞的线粒体基质内,它是缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增生有关的特异性精氨酸酶亚型。近来,越来越多的研究发现在缺氧性肺动脉离压中,精氨酸的表达明显増加,并导致了肺动脉平滑肌细胞的增生。实验证明抑制精氨酸的活性,可W减少肺动脉平滑肌细胞的增生,减轻肺动脉的重塑,但具体的机制并不清楚。同时缺氧诱到的Arg2表达増加的机制目前仍不清楚,需要进一步的阐明。炎性反应在肺动脉高压发病过程中受到了越来越多的关注,有大量的证据表明在缺氧诱导肺动脉高压情况下,其比-6的含量也是明思增加的,到目前为止,尚无报道比-6等炎症介质是否可W影响精氨酸酶的表达,所进我们提出研究比-6与Arg2的作用关系,抑制Arg2表达可W缓解缺氧性肺动脉高压的发展,其具体的机制包括抑制比-6等炎性介质,可W抑制Arg2的表达,通过减少D1和CDK4的表达,部分降低Akt和ERK的礎酸化等过程W减少肺动脉平滑肌细胞的增生,减轻肺动脉的重塑。基于W上思路,我们设计和实施了一系列体内和体外实验。2目的:(1)体内试验:观察精氨酸酶抑制剂对肺动脉重塑的影响。(2)体外实验:探讨精氨酸酶升高的机制及精氨酸酶抑制剂减少细胞増生的分子机制。3方法:3.1动物模型8周龄的60只雄性C57化/6J小鼠随机分为常氧组、PAH组和BEC组,每組20只。PAH组巧BEC组在含氧的10%低氧箱中喂养,常氧组与PAH组和BEC组均在同一个房间中喂养4周。所有的小鼠食物和水源都是一致的,实验第4周后安乐处死。3.2体重及血脂实验的0周和4周末,分别测量每组小鼠的体重。4周末检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(册L-C)的水平。3.3 I^ulton'S指数测量Fulton’S指数是右必室与左也室和室间隔重量的比重,它可W反映右也室肥大的程度,是判断右也室肥大及衰减的重要的指标。小鼠处死后,将小鼠左如室与室间隔作为一个整体与右也室剥离,并分别测量其质量,W计算化Iton'S指数。3.4组织病理学制备缺氧小鼠肺动脉组织切片,使用HE染色观察血管増生的情况,使用免疫组织化学的方法检测肺动脉平滑肌细胞的增生及比-6、MCP-1的表达情况。3.5细胞培养将人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs)在含有小牛血清的DMEM培养液中传至第四代,放在低氧条件下培养(1%化,5%〔化),分为常氧组、对照组、比-6组、比-6枯抗组(TCZ)、Arg干扰组(SiRNA-Arg2组)和B防组。比-6组加入比-6干预,比-6枯抗组和祀C组分别加入比-6受体掉抗剂TCZ(0.8mg/ml)、BECn mM)共培养,对照组不加入任何干预剂,它们同时培养48小时;ARG干扰组则加入ARG2为目标的siRM,培养120小时。3.6 HPASMC的增值测定及细胞计数使用MTT法测定HPASMCs增值。在96孔板中W每孔5000个细胞的密度种植,在放置缺氧条件前加入或不加干预剂,使用全波长多功能扫描仪570 nm波长分析样本。使用6孔板相同的密度种植hPASMCs,并在上述条件下进行处理。使用血细胞计数器进行细胞计数。3.7精氨酸酶活性为了检测精氨酸酶的活性,我们裂解了平滑m细胞制作成混合物样品。泡合物混匀,加热到loocrs分钟,后放置降至室温。加入发色剂(200 yl)的每一个样品分成两份放于微量培养板中,与尿素标准曲线比较在530 nm吸光度的不同。精氨酸酶的活性是计算尿素(umol)/分钟的量速率单位是蛋白/min)。对照组加入生理祐水,抑制剂组加入精氨酸酶抑制剂祀C,并各加入心精氨酸(IraM)。3.8siRNA为明确Arg2基因沉默时对hPASMC增生的影响,我们使用化armaFECT 1试剂说明书,对4巧2的1^^干化(3成齡)。511^祖-化曰1'1113阳(:了混合物(1?11)及新鲜培养液(1ml)分别放于6孔板中,在缺氧氧下培养24小时,再进行细胞计数或提取蛋白行Western blot分析。3.9RT-PCR搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取RNA,测量肺Arg2,cyclin D1,CDK4,,p27,W及肺动脉平滑肌细胞化-6,Arg2,cyclin Dl,C抓4,p27mRNA的表达。3.810 Western blot搜集小鼠的肺或肺动脉平滑肌细胞,提取蛋白,测量肺Arg2,巧clin Dl,CDK4,p27 W及肺动脉平酒肌细胞比-6,Arg2,巧clinDl,CDK4,p27,Akt,E版蛋白的表达。4结果4.1动物一般情况各组小鼠体重W小鼠血清TC、TG、10心(:和邸的水平浓度无显著统计学差异。4.么蛇C抑制了小鼠肺动脉平滑肌细胞的増生对病理组织切片服染色分析显示:常氧组肺动脉管壁没有发生明显的增厚,PAH姐和距C组肺动脉管壁都发生增厚。PAH组的管壁增厚程度明显高于BEC组(P0.05)和常氧组(P0.05),BEC组的管壁增厚程度要島于常氧组(P0.化)。对病理组织切片进斤a平滑肌染色分析显示;PAH组的平婿肌增厚程度明显高于邮C组(P0.05)和常氧組(P0.05),BEC组的管壁增厚程度要高于常氧组(P0.05)。PAH组肺动脉血管的内膜及外膜比-6表达增加,相对于常氧组表达明显增加(P0.化),而相对于BEC组差异不明思(P=0.的)4.3BEC抑制了精氨酸酶的表达在体内实验中,我们通过RT-PCR方法发现,BEC组小鼠肺组织中,Ar巧mRM的表达明显明显低于PAH组,而PAH组Arg2mRNA的表达要高于常氧组,但两组间没有显著性差异;通过肺组织提取的Arg2的蛋白表达水平也是相似的结果。这表明,在缺氧条件下,小鼠的Arg2的表达水平是增加的,BEC可抑制小鼠肺组织中Arg2的表达。4.4IL-6措抗剂巧制了精氨酸酶2的表达在体内试验中,化-6免疫组化显示,在PAH组和祀C组的肺动脉内膜及周围有明显的表达,与常氧组相比有显著差异,但是PAH组和祀C姐间没有显著差异;体外培养实验中,我们将比-6加入到肺动脉平滑肌细胞培养基中,提取细胞的Arg2mRNA和Arg2蛋白,与对照组相比,其表达水平均明显增加;使用比-6受体诘抗剂干预,我们发现其肺动脉平淆肌细胞Ar的mRNA的表达和Arg2蛋白的表达水平均较对照组下降。这表明比-6可W促进Arg2的表达。4.5Arginase II-siRNA,可W减少精氨酸酶2的表达使用siRM干扰肺动脉平滑化细胞,可W阻止缺氧诱导的Arg2蛋白的表达,使用Dharma阳CT试剂将W Arg2为目标的siRM转染到hPASMC中,在1%化化ypoxia)培养箱中培养120小时。使用Western blot方法分析对Arg2蛋白表达水平进行分析。我们发现与对照组相比,siRNA组的Arg2蛋白表达水平明显下降。4.6BEC可降低缺氧诱导的右也室的肥厚慢性缺氧可导致右屯室的肥厚,我们在这个研究中测量了扣Iton'S指数,结果盈示缺氧条件下可伴有化Iton’S指数的增加,而在BEC组其化Iton’S指数在部分程度上得W降低。此结果表明BEC可改善缺氧诱导的肺动脉压力和右也室肥厚。4.7 BEC及siRNA-ARG2可减少缺氧造成的hPASMCs的増生。我们通过肌T方法发现相对于缺氧组,BEC可抑制hPASMCs的增生,W Arg'2为目标的siRNA也明晶抑制hPASMCs的增生,细胞计数分析也得到了相似的结论。我们认为BEC对hPASMC的抑制作用是减缓肺动脉高压进展的重要机制。4.8BEC促使缺氧的hPASMCs停留在G1/G0期细胞的增值依赖于由G1/G0期转到G2/S期。此实验发现,通过BEC处理的hPASMCs,与对照组相比,有更大比率的细胞处在G,,G。期。4.9BEC可减少cyclin D1和CDK4表达,増加p27的表达。cyclinDl,CDK4和p27在细胞增值及细胞周期中起到关键的作用。我们发现在体外实验的HPASMCs中,cyclin D1,CDK4的mRNA和其蛋白表达水平都较BEC组的明显降低,而在服C处理的hPASMCs中,其p27的mRNA和蛋白表达都明湿高于对照组。这个结果表明BEC通过调节细胞周期的方式是减缓肺动脉高压发病发展的另外一个机制。4.10Tregs降低Akt和E版1/2稱酸化水平。已经有报道,Akt和ERK是肺动脉平滑肌细胞增生的主要途径之一。我们通过western bio方法检测体外的hPASMCs表达的Akt和ERK蛋白水平。我们发现,相对于对照组,BEC可W明显下调Akt和抓K蛋白的憐酸化水平。5结论(1)在缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模型中,.BEC可W减轻肺动脉血管的重塑,降低肺动脉的压力。(2)在细胞培养中,BEC可抑制Arg2的表达,通过减少D1和CDK4的表这,部分降低Akt和抓K的磯酸化等过程W减少肺动脉平滑肌细胞的增生,减轻肺动脉的重塑。(3)在缺氧条件下,比-6可W促进hPASMCs中Arg2的mRNA和其蛋白的表达。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R544.1

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