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《山东大学》 2015年
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拟南芥不同生态型响应盐胁迫的自然变异研究

孙验玲  
【摘要】:盐胁迫是影响植物生长和农作物产量的一个重要环境限制因素。盐胁迫易引发离子胁迫和渗透胁迫,最终导致植物叶面积扩展受阻、光合作用以及生物量积累降低等。植物在适应盐胁迫环境时形成了许多耐受调节机理,如Na+的外排、Na+区隔化进入液泡、可溶性物质的积累和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的清除等。深入认识植物耐盐生理和分子机制,不仅具有重要的科学意义,而且还能为将来作物的耐盐育种提供重要的理论指导。拟南芥作为科学研究的一种重要模式植物,其生态型分布在世界各地,形态多样,因此,不同生态型的拟南芥是研究植物对各种环境胁迫响应机制的良好材料。先前文献报道,植物的耐盐性是由多基因控制、多种生理生化及分子机制调控下的综合表现性状,但是,目前关于拟南芥不同生态型响应盐胁迫的自然变异及其调控机理仍不是很清楚,尚需进一步深入研究。因此,我们以本实验室保存的82种分布于不同地域的拟南芥生态型为实验材料,分别对其进行盐胁迫处理,共筛选出了7种耐盐生态型(以Col-0作参照),并对其应答盐胁迫的生理生化性状进行了较全面的分析和比较,进一步探究了拟南芥响应盐胁迫的自然变异及其分子调控机制,主要研究内容和结果如下:1.拟南芥耐盐生态型的筛选、鉴定和相关耐盐生理指标的测定82种不同拟南芥生态型分布在欧洲(Europe)、亚洲(Aisa)、东非(North Africa)和北美洲(North America)等,对此进行150 mM和200 mM NaCl处理,以Col-0做参照,共筛选出了7种耐盐生态型,分别是Bs-1 (Switzerland)、Mog-11 (France)、 Looe-2 (UK)、Got-1 (Germany)、Wil-1 (Russia)、Nd-1 (Germany)和Sav-0(Czech Rep)。为进一步确证其耐盐性,又进行了一系列不同浓度梯度(OmM、150 mM、180 mM和200 mM NaCl)的盐处理,结果表明,在上述不同的盐处理条件下,它们均表现出较强的耐盐性状,而且在高盐液态MS培养基中的短期盐胁迫或移栽入土后长期高盐溶液的浇灌处理后,也均表现出较强的耐盐性。进一步分析发现,与Col-0相比,各耐盐型拟南芥在盐胁迫下有较长的主根、较高的叶绿素含量以及较低的子叶白化率。另外,各耐盐型拟南芥在盐胁迫下积累较少的丙二醛(Malondialdehyde,MDA),表明其细胞膜伤害程度轻,耐盐能力强。2.拟南芥不同耐盐型在盐胁迫下的Na+、K+离子平衡的调控先前研究表明,细胞内高水平的K+和低的Na+/K+比率对植物的耐盐性起到至关重要的作用。我们的研究发现,与Col-0相比,无论是盐胁迫还是非盐胁迫状态下,各耐盐生态型植株中的Na+含量均无明显差异,表明Na+含量的变化并不是各耐盐生态型耐高盐胁迫的关键性因素。有意思的是,盐处理后,所检测生态型中K+含量均下降,但与Col-0相比,各耐盐型仍保持较高的K+含量,进而表现出较低的Na+/K+比率,这表明拟南芥各耐盐生态型中较高的K+含量对其耐盐性起到重要的调控作用。进一步采用非损伤微测技术对Col-0和各耐盐生态型中的K+流动情况进行测定,结果显示,在非胁迫状态下,所检测的各生态型均呈现为向细胞外的K+净流速,盐胁迫状态下亦如此,但与Col-0相比,各耐盐型均有较低的K+净流速,表明各耐盐型体内较高的K+含量是与其较低的K+净流速相一致的,同时也表明各耐盐型在盐胁迫下具有较强的K+滞留或阻碍K+流失的能力。进一步对K+吸收的重要转运载体基因AtHAK5、AtCHX17和AtKUP1的表达水平进行qRT-PCR检测,比较分析后发现,它们在各耐盐型中的表达水平与其高的K+含量呈现正相关性。盐处理后,AtHAKS在各耐盐型中的表达水平均明显高于Col-0,在Mog-11和Got-1中该基因的表达水平尤为显著,比Col-0高出10倍以上。另外,AtCHX17和AtKUPl也在盐胁迫后被显著诱导表达,尤其在耐盐型Mog-11、 Looe-2和Wil-1等中该基因的诱导表达更为明显。SOS信号通路相关基因和NHX及HKT蛋白家族编码基因是植物耐盐的重要调控因子,SOS信号通路中的AtSOSs和AtNHX1,分别调控Na+向外排出细胞和Na+进入液泡区隔化,而AtHKT1;1则参与了Na+由根向茎的运输过程,它们均是Na+转运相关的重要运输载体。为了检测这些转运载体在不同生态型中参与耐盐胁迫是否有差异,我们通过测序比较分析了各个耐盐生态型中的AtSOS1序列变异情况,结果发现,在该蛋白重要的C末端自抑制结构域中第1116位的氨基酸发生了突变(T1116A),但是,该位点的变异在盐敏感型中也存在,由此可知,该位点的突变并不能影响SOS1蛋白的功能。同样,耐盐型中的AtSOS2、AtSOS3、 AtNHX1和AtHKT1;1基因也无明显的有效突变。进一步通过qRT-PCR检测发现,盐胁迫下,各生态型中AtSOS基因的表达水平无明显变化,表明各生态型在调控Na+外排的效率上没有明显差别,这与其体内相似的Na+含量水平是相一致的。另外,在100mM NaCl处理3h后,与Col-0相比,耐盐型Mog-11、Looe-2和Sav-0中AtNHX1的表达水平下降;盐胁迫下,大多数耐盐型中AtHKT1;1的表达水平也较Col-0低。综上所述,我们的研究结果表明SOS信号通路、AtNHX1和AtHKT1;1在拟南芥各生态型中相当保守,在应答盐胁迫的过程中发挥基础性的调控作用,并不是造成各耐盐型和Col-0之间的耐盐性差异的关键调控因子。3.拟南芥不同耐盐型在盐胁迫下的可溶性物质的差异积累植物合成的可溶性物质的积累对细胞特别是处于胁迫状态下的细胞具有保护作用。研究发现,高盐胁迫下各耐盐型拟南芥中均有较高的可溶性物质(包括脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖)的积累,特别是脯氨酸的积累水平尤为显著,进一步研究发现,与Col-0相比,脯氨酸降解相关的基因AtProDH1和AtP5CDH在各耐盐型中的表达水平明显较低,这是与其较高的脯氨酸含量相一致的,而脯氨酸合成相关的基因AtP5CR、AtPSCS1和AtP5CS2没有显著变化。4.拟南芥不同耐盐型在盐胁迫下的差异性ROS应答ROS是介导盐胁迫响应的重要信号分子。为了阐明ROS信号在不同生态型参与耐盐胁迫的作用机制,我们对各耐盐的生态型进行了ROS水平检测及相关基因表达分析。NBT和DAB染色检测的结果表明,与Col-0相比,盐处理后各耐盐型确实具有较低的ROS水平。另外,我们也检测了SOD的活性,结果显示各耐盐型中均有较高的SOD活性,进一步研究发现,编码一种SOD的基因AtCSDl在各耐盐型中具有较高的表达水平(Mog-11除外)。同样,AtCAT2和AtAPX2在各耐盐型中的表达水平也较高,尤其是耐盐型Bs-1、Mog-11、Wil-1和Sav-0中AtAPX2的表达水平更为显著。另外,ROS信号途径中的2个上游转录因子AtZATIO和AtZAT12在各耐盐型中的表达水平也较高。由此可以推测,各耐盐型都具有较强的清除ROS的能力,也是其具有较高耐盐性的原因之一。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q945.78

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