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拟南芥CML25调控花粉萌发及花粉管生长的机理研究

王双双  
【摘要】:花粉正常萌发和花粉管快速极性生长是保证被子植物顺利进行双受精并完成其生活史的关键,但其中具体的分子调节机制并不完全清楚。已有研究表明,Ca2+作为植物细胞普遍存在的第二信使,也同样是花粉萌发和花粉管生长必须的调控因子,这预示着Ca2+信号相关的信号通路对于花粉萌发和花粉管生长至关重要,但是Ca2+下游参与调控这些生理过程的具体分子机制和信号转导途径,到目前仍所知甚少。Ca2+作为胞内第二信使,可以被具有EF-手型结构(EF-hand motif) Ca2+结合区域的钙感受蛋白结合,后者在结合Ca2+后蛋白构象发生改变,进而将Ca2+信号传递下去,钙调素类似蛋白(Calmodulin Like Protein; CML)家族即是钙感受蛋白的重要组成成员。CML是植物细胞中特有的钙感受蛋白,在拟南芥中有50个成员,与钙调素蛋白有一定序列相似性,但家族中绝大多数成员的生理功能未知。通过对基因芯片数据进行分析,发现CML25在拟南芥花粉及花粉管中大量且特异的表达,预示着该基因在调控花粉萌发及花粉管生长过程中可能起着重要作用。因此,本论文以拟南芥Ca2+结合蛋白CML25作为研究对象,详细探讨其调控花粉萌发和花粉管生长的功能和作用机制,发现CML25作为一个新的钙信号下游响应元件,参与了Ca2+调控花粉萌发及花粉管生长的信号转导途径。为明确CML25的生化特性及生理功能,本论文首先对CML25的Ca2+结合特性检验、组织定位和在花粉萌发及花粉管生长过程中的作用进行了分析。得到高纯度的CML25蛋白后进行Ca2+结合实验,结果表明CML25与钙结合后其蛋白电泳迁移率发生改变,证明其具有Ca2+结合能力,并在结合Ca2+后发生了蛋白构象变化。通过qPCR和CML25 promoter连接GUS进行该基因组织表达分析,结果显示CML25在花粉和花粉管中大量表达,与芯片数据一致,预示着CML25可能与雄配子体的正常生理功能相关。为了研究CML25的生理功能,筛选获得CML25两个T-DNA有效插入突变体cml25-1和cml25-2,利用体外和体内花粉萌发和花粉管生长表型检测体系发现,突变体花粉萌发率降低,花粉管生长速率及最终长度降低,并导致了种子结实率下降,而且这些性状可以被重新表达的CML25恢复。以上结果显示,CML25是在花粉和花粉管大量表达的钙结合蛋白,并作为正调控元件参与了花粉萌发及花粉管生长的生理过程。为进一步明确CML25参与花粉萌发及花粉管生长调控的作用机理,对其亚细胞定位、功能缺失突变体对胞外离子浓度变化的反应差异及可能参与的胞内信号途径进行了系统分析。利用CML25::GFP进行亚细胞定位分析,结果显示CML25是胞质定位蛋白,可能参与介导胞质Ca2+信号;通过分析梯度胞外Ca2+和K+浓度对花粉萌发和花粉管生长的影响,发现cml25突变体对胞外Ca2+和K+浓度变化的响应敏感性降低:利用Ca2+结合荧光染料Fluo-3标记发现,cml25突变体花粉细胞中胞内Ca2+浓度增加,且花粉管顶端Ca2+正常的浓度梯度也受到了破坏,说明胞内Ca2+信号发生了改变;利用花粉及花粉管原生质体电生理膜片钳技术,研究全细胞K+内向电流对胞质Ca2+浓度变化的响应,结果表明cml25突变体中胞内高浓度的Ca2+对花粉和花粉管原生质体质膜内向K+电流的抑制作用不敏感。以上结果显示,CML25可能在胞内介导了Ca2+信号对成熟花粉和花粉管K+的吸收过程,进而参与Ca2+调控的花粉萌发及花粉管生长。为深入研究CML25参与介导的钙信号调控跨膜离子转运的下游分子机制和信号网络,本论文进行了CML25互作蛋白的筛选。利用酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得了CML25可能的相互作用蛋白CIP1 (CML25 Interacting Protein 1),并进一步利用酵母、BiFC技术结合叶肉原生质体瞬时转化方法及亚细胞定位等方法,证明CML25与CIP1存在互作,且发生互作的位置在细胞质中。利用CIP1的过表达株系(CIP1-OE5, CIP1-OE6)和沉默株系(CDP1-R1,CIP1-R2)进行花粉萌发及花粉管生长实验,发现CIP1是花粉管生长的负调控因子。综上所述,本论文研究发现,在花粉和花粉管中高效表达的钙调素类似蛋白CML25,可以为Ca2+结合调控,并在胞质内作为正调控因子,介导Ca2+调控的质膜K+内流,调控拟南芥花粉萌发和花粉管生长。


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