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《山东大学》 2015年
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DKK1抑制巨噬细胞内脂质沉积及其相关分子机制

张瑜  
【摘要】:研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的发病率与日俱增,易损斑块发生的破裂和继发的血栓形成,是诱发急性冠脉综合征、心肌梗死和中风等多种疾病的主要机制之一。传统观点认为,动脉粥样硬化始于血管壁内皮损伤,单核细胞募集并迁入内膜下转变为巨噬细胞,识别并吞噬脂质形成泡沫细胞,同时募集白细胞、平滑肌细胞等进入斑块,积聚脂质、中央核心坏死,导致斑块破裂的发生。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是动脉粥样硬化发生发展中的重要因素。研究发现,ox-LDL可以损伤内皮,诱导单核细胞趋化,促进平滑肌增殖迁移,加速泡沫细胞形成,引起炎症反应,加剧脂质沉积等动脉粥样硬化的发生和发展过程。研究发现,Wnt信号通路参与细胞粘附、干细胞更新、肿瘤发生和细胞分化、增殖、迁移、组织发生等多种分子生物学变化。各种环境因素能够调节Wnt通路的启动和关闭,通过结合胞膜上的LRP5/6等受体,调节胞质中的β-catenin的积累和降解,影响(3-catenin的靶基因表达而调节细胞的功能变化。Wnt通路存在许多胞外拮抗分子,其中DKK家族是一种分泌型拮抗蛋白,除DKK3外的DKK亚家族成员(DKK1,2,4)均可参与Wnt信号调控。目前有关DKK家族中研究最多的蛋白为DKK1。DKK1与心血管疾病的发生存在着密切的关系,而在ox-LDL刺激下巨噬细胞内的DKK1表达水平存在着怎样的变化尚未见报道。研究目的:(1)明确ox-LDL对巨噬细胞中DKK1的调节作用;(2)明确LXRs在ox-LDL调节DKK1中的作用;(3)明确β-catenin与LXRs的相互作用在ox-LDL调节DKK1中的作用。研究方法:1.细胞培养购自ATCC的人单核/巨噬细胞系以RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素)悬浮培养。并以终浓度为160nM的PMA诱导贴壁为巨噬细胞,作为实验的模型细胞。2.细胞转染β-catenin、LXRa和LXRβ的siRNA和阴性对照Negative control siRNA均由上海吉玛公司合成,按照脂质体Lipo-2000的说明书进行转染后,给予不同的刺激并检测。3.蛋白质印迹法(Western Blot)提取不同刺激后细胞的蛋白,99℃加热10分钟,SDS-PAGE电泳,按照对应的分子量切胶,湿转法转膜,封闭,一抗孵育4℃过夜,洗膜后二抗孵育1小时20分钟,洗去附着的二抗,化学发光,分析对应的蛋白条带的灰度值。4.实时荧光定量PCR分析刺激结束后利用Trizol法提取细胞中的总核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA),测定提取的RNA浓度,使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸(Complementary Deoxyribonucleic Acid, cDNA),再使用TaKaRa公司的SYBR Green实时定量PCR试剂盒进行PCR反应,以测定DKKl和内参蛋白的mRNA表达情况。5.DKK1浓度的测定使用RD公司的Human DKK1 Immunoassay ELISA试剂盒检测巨噬细胞分泌到胞外的DKK1浓度。按照ELISA试剂盒说明书配制DKKl标准品并稀释样品,添加到事先包被有DKK1单克隆抗体的96孔酶标板中,并依次加入说明书中相应的试剂,使用酶标仪测定450nm各孔吸光度,并绘制标准曲线,计算不同刺激下分泌到胞外的DKK1浓度。6.免疫共沉淀不同刺激后使用Western及IP细胞裂解液提取细胞中总蛋白,留取部分加入5×蛋白上样缓冲液后煮沸留作对照,剩余蛋白裂解液中加入事先配好的50%琼脂糖磁珠和合适浓度的一抗原液4℃孵育过夜,清洗琼脂糖磁珠后,加入2×蛋白上样缓冲液后煮沸,使得结合在磁珠上的蛋白脱离,留取上清弃磁珠,Western Blot检测相关蛋白的含量。7.统计学分析实验所得数据均以均数±标准误表示,采用SPSS软件进行统计分析。多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P0.05代表统计学有显著性差异。研究结果1. ox-LDL上调巨噬细胞DKKl的表达100mg/L ox-LDL刺激6小时和9小时显著上调巨噬细胞内DKK1蛋白的表达(P0.05)。浓度梯度刺激6小时,100mg/L ox-LDL刺激对DKK1蛋白的上调达到峰值(P0.05)。同时,50mg/L和100mg/L ox-LDL刺激6小时能够上调巨噬细胞DKK1 mRNA水平(P0.05)。而100mg/L ox-LDL刺激9小时,DKK1的上清水平显著上调(P0.05)。2.经典Wnt通路参与ox-LDL对巨噬细胞中DKKl表达的调节与阴性对照组相比,β-catenin siRNA能够显著下调巨噬细胞中β-catenin及其靶基因CyclinD1的表达水平(P0.05)。同时ox-LDL刺激6小时,对DKK1的上调作用被β-catenin干扰阻断,表明经典Wnt通路参与ox-LDL对DKK1的上调作用。3.LXRa参与ox-LDL对巨噬细胞中DKKl表达的调节,而LXRβ参与与对照组相比,LXRs激动剂T0901317、GW3965、22-(R)-OH能够显著阻断ox-LDL对DKK1的上调作用(P0.05)。而LXRs抑制剂GGPP和22-(S)-OH能够显著上调巨噬细胞内DKK1的表达水平,同时LXRs抑制剂组与ox-LDL刺激组无统计学差异(P0.05)。与阴性对照组相比,LXRa干扰组中巨噬细胞中DKK1的表达水平显著上调(P0.05)。而LXRP干扰却不能上调巨噬细胞中DKK1的水平(P0.05)。4. ox-LDL下调巨噬细胞中LXRs与P-catenin的相互作用免疫共沉淀结果显示,与空白对照组相比,ox-LDL不仅下调了巨噬细胞中LXRa与β-catenin的相互结合,同时亦减少了巨噬细胞中β-catenin与LXRβ的相互结合。结论(1) ox-LDL能够上调巨噬细胞中DKK1的表达;(2) ox-LDL能够减少LXRa对β-catenin的抑制作用来上调DKK1的表达。研究背景Wnt信号通路是一条与肿瘤发生、发展和脊椎动物胚胎发育有重要关系的信号通路,近年来在心血管领域的研究越来越受到人们的关注。DKK1作为经典Wnt通路的分泌型抑制剂,除了参与调节皮肤色素和厚度、骨骼的形成及稳态、神经退行性疾病、脂质代谢等,DKKl在心血管疾病中的作用也不容忽视。DKK1不仅影响心肌细胞、心脏瓣膜等多种心血管成分的生成,还可以促进主动脉内皮的的内皮-间质转化来调节动脉粥样硬化的发生发展,同时DKK1可以增加内皮和血小板之间的炎症反应,发挥促动脉粥样硬化和增加斑块易损性的作用。DKK1与脂肪代谢存在着密不可分的关系。研究发现,DKK1能够促进脂肪生成的过程,同时发现可源于脂肪细胞分布异常的成人肥胖,其脂肪生成过程异常主要由于经典Wnt通路的异常活化和低水平的DKK1所致。在动脉粥样硬化过程中DKK1与巨噬细胞的脂质代谢功能是否存在着一定的联系未见报道。巨噬细胞吞噬脂质变为泡沫细胞在动脉粥样硬化中起到了重要的作用。巨噬细胞的脂质代谢主要分为脂质的吞噬、转化和排出三个过程来维持其稳态和平衡。巨噬细胞通过胞膜受体识别摄取脂蛋白和脂蛋白颗粒,并运送到溶酶体后被分解为氨基酸及游离胆固醇。继而酯酰辅酶A胆固醇脂酰转移酶(ACAT)将其转化为胆固醇酯储存在胞质中。当胆固醇接收体如HDL, apoA-Ⅰ等存在时,胞内的游离胆固醇可经过胞膜上的受体ABCA1、ABCG1等外流,减少胞质内脂质过度沉积。在动脉粥样硬化过程中DKK1与巨噬细胞的脂质代谢功能是否存在着一定的联系未见报道。研究目的:(1)明确DKK1对巨噬细胞脂质代谢的作用;(2)明确经典Wnt通路在DKK1调节脂质代谢中发挥的作用;(3)明确巨噬细胞中DKK1对脂质受体LOX-1和ABCA/G1的调节及相关信号通路。研究方法:1.细胞培养本实验使用的THP-1细胞系为单核/巨噬细胞系,购自美国ATCC中心。将PMA加入培养基中,诱导细胞贴壁生长,成为THP-1来源的巨噬细胞。2.细胞转染DKK1、β-catenin和STAT3的siRNA和阴性对照Negative control siRNA均由上海吉玛公司合成,脂质体转染法转染,具体步骤参照Lipo-2000的说明书进行。3.蛋白质印迹法(Western Blot)刺激结束后RIPA裂解液提取蛋白,加入5×蛋白上样缓冲液,煮沸,SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,封闭,一抗孵育4℃过夜,洗去附着的一抗,对应的二抗室温孵育,洗去附着的二抗,化学发光法检测相应的蛋白灰度值。4.细胞油红O染色刺激结束后,4%甲醛固定细胞,使用配制的油红O工作液染色10分钟,洗去浮色,苏木素染核2分钟,盐酸酒精分化15秒,置于清水中返蓝7分钟,甘油明胶封片短期保存,并拍照统计脂质沉积情况。5. Dil-ox-LDL吞噬实验给予细胞不同刺激后加入Dil-ox-LDL孵育过夜,避光弃去培养基,4%甲醛固定,1×PBS洗去附着的甲醛,DAPI染核8分钟,1×PBS冲洗细胞,防荧光淬灭剂封片,共聚焦显微镜549nm激发波长下检测荧光强度,统计Dil-ox-LDL吞噬情况。6.统计学分析实验数据均以均数土标准误表示,两组之间的统计分析采用非配对t检验,多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P0.05代表统计学有显著性差异。研究结果1.DKKl抑制巨噬细胞内脂质沉积与阴性对照组相比,DKK1干扰组油红O染色结果显示巨噬细胞胞内脂质沉积显著增加(P0.05)。与空白对照组相比,rDKKl显著降低了巨噬细胞胞内脂质沉积(P0.05)。Dil-ox-LDL吞噬实验结果表明,与阴性对照相比,DKKl干扰组显著上调了巨噬细胞的脂质吞噬能力(P0.05),而rDKK1组的荧光强度则显著低于空白对照组(P0.05)。以上结果表明DKK1能够抑制巨噬细胞内脂质沉积。2.Wnt通路参与DKK1对巨噬细胞脂质沉积的抑制作用与阴性对照组相比,DKK1干扰组的(β-catenin水平显著上调,而P-β-catenin水平显著下调(P0.05)。相反,rDKK1能够阻断ox-LDL对P-catenin的上调和P-β-catenin的下调作用(P0.05)。与阴性对照组相比,β-catenin干扰组的油红O强度和荧光强度均显著下调(P0.05)。表明抑制经典Wnt通路可以减少巨噬细胞胞内脂质沉积。3.DKKl通过抑制经典Wnt通路下调巨噬细胞脂质受体LOX-1的表达rDKK1能够显著逆转ox-LDL对LOX-1的上调作用(P0.05);与阴性对照组相比,DKK1干扰组能够显著上调LOX-1的表达,进一步加强ox-LDL对LOX-1的上调作用(P0.05);与阴性对照组相比,β-catenin干扰能够阻断ox-LDL上调巨噬细胞LOX-1的表达情况(P0.05)。4.DKKl通过活化STAT3通路上调巨噬细胞脂质受体ABCA/G1的表达与空白对照组相比,rDKK1刺激10-30分钟能够显著上调P-STAT3的表达,活化STAT3通路(P0.05)。与空白对照组相比,rDKK1能够显著上调ABCA1和ABCG1的表达(P0.05);而在加入STAT3抑制剂逆转rDKK1对ABCA1和ABCG1的上调作用(P0.05);与阴性对照组相比,STAT3干扰组能够阻断rDKK1对ABCAl的上调作用(P0.05)。结论(1)DKK1能够抑制巨噬细胞内脂质沉积;(2)DKK1通过抑制Wnt/β-catenin通路下调LOX-1的表达;(3)DKKl通过活化STAT3通路上调ABCA/G1的表达。研究背景自噬(Autophagy)是真核生物进化过程中相对保守的生命现象,是指细胞利用溶酶体水解酶水解细胞内容物的过程,分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬是指在饥饿等环境因素刺激下,胞质内形成双层膜结构将胞质内容物包裹运送至溶酶体被水解酶降解的过程;而微自噬是指溶酶体直接吞噬胞质内容物清除的现象;分子伴侣介导的自噬,是指在分子伴侣的协助下,胞内容物被运送至溶酶体降解的现象。自噬能够影响细胞的生存,在肿瘤的发生发展中起到了重要的作用。一方面在早期肿瘤中自噬能够阻断肿瘤的发生,而抑制自噬水平会导致肿瘤的恶化;另一方面的肿瘤成熟后过快的生长、缺血,导致肿瘤内环境恶劣,诱导自噬的发生,作为对周围不良环境的应激反应,此时的自噬会降解坏死的细胞器等胞内容物,阻止肿瘤细胞的凋亡坏死,促进肿瘤的发生发展。自噬的本质是一种膜运输系统,能够形成双层膜结构转运胞内物质。研究发现,存在一种自噬小体能够将胞质内的脂质运送至溶酶体降解,称为自噬脂小体(Lipophagy)。胞质内的自噬小体与脂滴融合形成自噬脂小体后,移动到溶酶体处与之结合形成自噬脂滴溶酶体,其中的胆固醇酯在溶酶体中被降解为游离的胆固醇,并通过胆固醇逆向转运运出胞外。研究表明,Wnt/β-catenin通路对于基础状态和应激状态下的自噬水平均起到负调控的作用;而自噬活化时β-catenin能够发生自噬性降解来抑制Wnt通路,形成一个负反馈调节。然而自噬在DKK1对脂质代谢的调节过程中发挥着的作用尚未见报道。研究目的(1)明确DKK1对巨噬细胞中自噬水平的影响;(2) 明确自噬水平的改变是否参与DKK1对脂质代谢的调节。研究方法1.细胞培养本实验使用单核/巨噬细胞系THP-1细胞。将THP-1细胞种板后,以PMA诱导为巨噬细胞作为实验模型。2.细胞转染DKK1 siRNA、ATG5 siRNA和Negative control siRNA均由上海吉玛公司合成,对细胞进行脂质体转染,转染步骤按照Lipo-2000说明书进行。3.蛋白质印迹法(Western Blot)给予不同刺激后RIPA裂解液提取细胞蛋白,煮沸,SDS-PAGE电泳,按照对应的分子量切胶,湿转法转膜,封闭,4℃一抗孵育过夜,洗膜,室温二抗孵育1小时20分钟,洗膜,化学发光法发光,分析蛋白条带灰度。4.巨噬细胞吞噬功能检测给予不同刺激后,加入ac-LDL刺激过夜,4%甲醛固定30分钟,油红O工作液染色10分钟,洗去浮色,苏木素染核2分钟,盐酸酒精去分化15秒,置于清水中返蓝7分钟后,甘油明胶封片,拍照并统计胞质内的脂质沉积情况。细胞给予不同刺激后,加入Dil-ac-LDL避光孵育过夜,弃去培养基,1×PBS冲洗细胞,4%甲醛固定,1×PBS冲洗细胞,DAPI染核8分钟,1×PBS冲洗细胞,抗荧光淬灭剂封片,共聚焦显微镜549nm激发波长下检测荧光强度,以检测巨噬细胞对Dil-ac-LDL的吞噬能力。5.免疫共沉淀给予不同刺激后,Western及IP细胞裂解液提取细胞蛋白,留取部分裂解液,加入5×蛋白上样缓冲液,煮沸留作对照。加入50%琼脂糖磁珠和适当浓度的一抗原液,4℃孵育过夜,清洗磁珠,加入2×蛋白上样缓冲液煮沸,留取上清,Western Blot检测相关蛋白的含量。6.统计学分析实验数据均以均数±标准误表示,采用SPSS软件进行统计分析。多组之间的统计分析采用单因素方差分析,P0.05代表统计学有显著性差异。研究结果1.DKKl上调巨噬细胞中自噬的水平本研究以检测巨噬细胞中自噬的标志性分子LC3-II的表达来评估自噬水平。基础水平的细胞中LC3-Ⅱ的表达水平较低,当加入自噬诱导剂px-LDL、 Rapamycin和EBSS时,LC3-Ⅱ的表达明显升高,同时加入rDKK1能够显著增加细胞内的LC3-II表达水平(P0.05)。但使用DKK1 siRNA干扰巨噬细胞中DKKl的表达时,与阴性对照组相比,自噬诱导剂升高的LC3-II水平被显著下调(P0.05),甚至低于基础水平。使用自噬的抑制剂3-MA和LY294002时,:DKK1上调的LC3-Ⅱ表达被显著下调(P0.05)。2.DKKl通过上调自噬水平来抑制巨噬细胞中的脂质沉积与rDKKl刺激组相比,加入3-MA阻断自噬水平后,胞质内的脂质沉积显著增加;与rDKKl刺激的阴性对照组相比,ATG5干扰组的胞内脂质沉积也恢复到了基础水平(P0.05)。Dil-ac-LDL结果显示,使用3-MA和ATG5小干扰后,rDKKl对巨噬细胞的Dil-ac-LDL吞噬的抑制作用被逆转(P0.05)。3.DKKl通过上调自噬水平来调节巨噬细胞脂质受体的表达在rDKKl刺激的同时加入3-MA和ATG5小干扰下调巨噬细胞自噬水平时,与单纯rDKK1刺激组相比,LOX-1的水平有所上调(P0.05),而ABCA1的水平分别下调71%(3-MA组)和68%(ATG5干扰组),ABCG1仅下调20%(3-MA组)和34%(ATG5干扰组)(P0.05)。4.DKK1能够通过自噬化降解下调巨噬细胞中的β-catenin的水平与空白对照组相比,rDKKl显著下调巨噬细胞中β-catenin的水平,而使用了蛋白酶体抑制剂MG-132和自噬抑制剂3-MA时,rDKKl对β-catenin的下调作用被阻断(P0.05)。同时与阴性对照组相比,加入rDKK1组下调β-catenin的水平,ATG5干扰后rDKK1刺激组的β-catenin的水平显著上调(P0.05)。免疫共沉淀结果显示,与空白对照组相比,rDKK1刺激组LC3B与β-catenin的表达水平均上调,表明rDKKl上调巨噬细胞中LC3B与β-catenin的结合。结论(1)DKK1能够上调巨噬细胞的自噬水平来抑制脂质代谢;(2)DKK1通过自噬调节脂质受体LOX-1和ABCA/G1的表达。(3)DKK1能够促进巨噬细胞中β-catenin的自噬化降解。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R543.5

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