不同冷冻保护剂在羊卵巢整体冻存中的效果比较

【摘要】：目的随着诊断及治疗手段的进步,生育期女性癌症患者的生存率显著提升,但是,这些治疗手段(如放化疗)可能造成卵巢功能下降甚至衰竭。卵巢皮质组织深低温冻存现已作为放化疗前保存生育力的方法应用于临床,但受限于移植后组织缺血损伤以及大量卵泡损失,而完整卵巢移植通过吻合血管可恢复血供,理论上能够克服这个难题。完整卵巢冷冻与皮质冷冻相似,常采用二甲基亚砜(DMSO)、甘油、动物血清等冷冻保护剂,但某些冷冻保护剂对组织有一定毒性,且完整卵巢冷冻保护剂的渗透及去除较皮质块更困难。本实验应用自制梯度浓度混合程控降温器官灌注仪,灌注不同冷冻保护剂,并进行行程序化冷冻,探讨其冻融羊完整卵巢的冷冻效果并筛选最佳冷冻保护剂组合。方法28只羊卵巢均来自6至8个月、体重约30 kg的未孕母羊,随机分配到新鲜对照组(A组)；海藻糖组(B组)；甘油保护剂组(C组)；DMSO组(D组),每组7只卵巢。对B、C、D组卵巢,通过卵巢动脉插管并行丝线结扎固定,与梯度浓度混合程控降温器官灌注仪相连,向各组卵巢灌注相应的冷冻保护剂。然后行程序化冷冻并投入液氮保存。将A组及复苏后的B、C、D组卵巢通过分为两半,其中1/2用4%多聚甲醛固定并制作切片、染色,行组织学分析及原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测,另1/2提取组织mRNA并通过RT-PCR技术检测组织Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)及冷诱导RNA结合蛋白(Cold Inducible RNA-binding Protein, CIRP)的mRNA表达。结 果1.新鲜对照组的正常形态卵泡比率(93.46±2.30%)显著高于甘油组(88.03±4.80%)及DMSO组(80.85±2.28%),差异有统计学意义(P0.05)。海藻糖组(90.29±2.30%)正常卵泡形态比率与新鲜对照组无显著性差异(P=0.07)。2.新鲜对照组(1114.68±184.24个/400x视野)基质细胞密度高于B、C、D三组冻存组,其与DMSO组(906.14±304.78个/400×视野)差异具有统计学意义(P0.05)。海藻糖组(1020.83±278.39个/400x视野)及甘油组(1089.38±573.13个/400×视野)基质细胞密度与新鲜组差异无统计学意义(P0.05)。3.新鲜对照组TUNEL反应阳性的细胞数目(13.86±13.22个/400x视野)凋亡数目明显少于三组冷冻组,差异具有统计学意义(P0.05),冻存组中,海藻糖组(73.14±32.01个/400x视野)凋亡细胞数少于甘油组(166.43±60.88个/400×视野)及DMSO(250.29±85.90个/400x视野)组,差异具有统计学意义(P0.05)。4.新鲜对照组及海藻糖组BAX mRNA相对GAPDH的表达量分别为0.016±0.019和0.026+0.024,明显低于甘油组及DMSO组的相对表达量0.081±0.075、0.099±0.125,差异具有统计学意义(P0.05)；三组冻存组的CIRP基因mRNA相对GAPDH的表达量均高于新鲜对照组(0.164±0.121),具有显著性差异(P0.05),且海藻糖组CIRP基因的mRNA相对表达量(0.512±0.226)明显高于甘油组(0.252±0.129)及DMSO组(0.224±0.093),差异具有统计学意义(P0.05)。结论1.羊完整卵巢冷冻复苏后卵泡形态结构良好,基质细胞密度可较好维持,具有一定的抗凋亡活性,说明低温冻存羊完整卵巢具有可行性。2.海藻糖组的冷冻保护剂在组织结构保存及抑制细胞凋亡方面优于甘油组及DMSO组。