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《山东大学》 2015年
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TRB3介导的脂肪组织巨噬细胞极化与糖尿病冠状动脉病变关系的研究

韩露  
【摘要】:背景糖尿病不仅是冠心病的主要危险因素,而且是冠心病的独立危险因素。合并糖尿病的冠心病患者具有以下特点:冠状动脉易损斑块发生率高、病变范围广泛、常合并多支病变、临床治疗效果差,死亡率是单纯冠心病死亡率的2-4倍。但是,糖尿病导致冠心病患者冠状动脉病变程度加重的具体机制尚不清楚。因此,探索合并糖尿病的冠心病患者冠状动脉粥样硬化斑块病变严重的深层次机制,建立以机制为导向的治疗措施成为近年来防治糖尿病心血管事件发生的研究热点。内脏脂肪组织功能紊乱在动脉粥样硬化性心脏病的发生发展中发挥了重要作用。心外膜脂肪组织作为一种特殊的内脏脂肪组织,其解剖位置近于心脏,可以通过旁分泌与血管分泌的方式分泌多种化学因子,直接作用于心脏及相关血管。CT扫描研究证实,心外膜脂肪组织体积与冠心病严重程度密切相关。糖尿病心外膜脂肪组织存在功能紊乱,表现为糖尿病心外膜脂肪组织厚度增加,MCP-1、瘦素等促炎症分泌因子增加。因此,糖尿病患者心外膜脂肪组织功能紊乱可能是导致糖尿病患者冠心病病情恶化的重要因素。脂肪组织巨噬细胞浸润启动了脂肪组织慢性炎症过程,在脂肪组织功能紊乱的发生发展中起着尤为重要的作用。巨噬细胞主要分为促炎症的M1型巨噬细胞及抗炎症的M2型巨噬细胞。与单纯的脂肪组织巨噬细胞数量增多相比,巨噬细胞M1/M2比例失调与脂肪组织慢性炎症、糖尿病及冠心病关系更为密切。糖尿病引起的糖酯代谢异常可进一步加重脂肪组织功能紊乱,两者之间形成恶性循环。因此,脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值的增加可能在糖尿病与心外膜脂肪组织功能紊乱的恶性循环中起着关键作用。但巨噬细胞极化的具体机制尚不清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是核受体家族成员之一,是调节巨噬细胞极化的关键分子。巨噬细胞PPARγ基因敲除可以抑制巨噬细胞向M2型转化;并且,在缺乏PPARγ调节促炎症因子表达的情况下,肥胖或炎症应激可以促进巨噬细胞由M2型向M1型转化。TRB3具有负调控PPARγ信号转导通路的作用,促进胰岛素抵抗;TRB3基因Q84R错义突变患者心血管危险增加。因此,我们推测TRB3可能通过抑制PPARγ转录,调节巨噬细胞M1/M2比例的改变,从而参与了糖尿病与脂肪组织功能紊乱恶性循环。本研究选取了进行冠状动脉搭桥手术的单纯冠心病与合并糖尿病的冠心病患者,手术中获取患者的脂肪组织,检测合并糖尿病的冠心病患者心外膜与皮下脂肪组织巨噬细胞极化与TRB3/PPARγ信号转导通路的改变,并分析脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值与冠状动脉病变严重程度的关系,以探讨糖尿病是否是通过诱导巨噬细胞M1/M2比值的改变而加重了冠状动脉病变进程。目的1.探讨单纯冠心病与合并糖尿病的冠心病患者心外膜与皮下脂肪组织中巨噬细胞数量、M1/M2型巨噬细胞比例的不同;2.探讨心外膜与皮下脂肪组织中巨噬细胞M1/M2型比值与冠心病严重程度的关系;3.检测单纯冠心病与合并糖尿病的冠心病患者心外膜与皮下脂肪组织中TRB3/PPAR γ信号通路蛋白表达水平的改变。方法1.冠心病患者脂肪组织的获取:收集拟进行冠状动脉搭桥手术的冠心病患者,分为单纯冠心病组(n=30)与合并糖尿病的冠心病组(n=30),在患者知情同意的基础上,手术中获取患者的左室前壁心外膜脂肪组织与胸骨前的皮下脂肪组织。2.冠心病患者冠状动脉严重程度的评估:通过冠状动脉造影,采用Gensini评分方法评价各患者冠状动脉病变严重程度。3.血液生化指标检测:血糖、血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)及血清胰岛素。4.病理学检测:对心外膜与皮下脂肪组织分别进行HE染色;通过免疫组织化学染色的方法检测脂肪组织内巨噬细胞总量(F4/80)、M1型巨噬细胞(CDllc)、M2型巨噬细胞(CD206)的含量,计算巨噬细胞M1/M2比值;通过免疫组织化学染色的方法检测脂肪组织内促炎症因子单核细胞趋化因子1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及白介素6(IL-6)与抗炎症因子白介素10(IL-10)的表达水平。5.实时定量RT-PCR检测:取新鲜心外膜与皮下脂肪组织,提取RNA,实时定量荧光RT-PCR检测脂肪合成酶(FAS)、围脂滴蛋白(Perilipin)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂肪酶(HSL)、脂联素(Adiponectin).瘦素(leptin)mRNA表达水平。6.Western Blot检测:取新鲜心外膜与皮下脂肪组织,提取蛋白质,Western Blot检测脂肪组织葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体底物1(IRS1)蛋白表达水平,以及TRB3/PPARγ信号通路的蛋白表达量。结果1.患者的一般临床特征:(1)合并糖尿病的冠心病患者与单纯冠心病患者在年龄、性别、体重及血压方面无明显统计学差异;与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者腰围(WC)(90.67±7.07 vs 95.8±7.43,P=0.008)、臀围(HC) (95.43±5.83 vs 98.27±4.81,P=0.044)及体重指数(BMI) (24.45±2.41 vs 25.84±2.41, P=0.029)均显著增加;(2)与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者Gensini评分(74.13±41.1 vs 114.73±54.47,P=0.002)显著增高。2.患者血清学指标改变:合并糖尿病的冠心病患者与单纯冠心病患者血清TC、LDL-c水平无显著统计学差异;与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者空腹血糖(4.91±0.53 vs 7.41±1.99,P0.001).TG (1.33±0.63 vs 1.74±0.84,P=0.024)及FFA(65.73±36.21 vs 96.50±67.90,P=0.034)显著增加,而HDL-c显著降低(1.15±0.23 vs 1.03±0.19,P=0.0024)。3.病理学分析:(1)心外膜脂肪细胞明显小于皮下脂肪细胞,与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织细胞大小不均,排列错乱,并出现较大的脂肪细胞;与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪细胞体积均明显增大;(2)与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织巨噬细胞浸润明显增多(8.0382±0.79003 vs 14.993±1.87488,P=0.003; 5.7918±0.66575 vs 9.4504±1.23046,P=0.007);更为重要地是,在合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织中,除了巨噬细胞总量的增多,M1与M2型巨噬细胞含量均有显著增加,然而,M2型巨噬细胞含量增加的程度明显低于M1型巨噬细胞,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值显著增加(0.8893±0.06104 vs 2.3085±0.30445,P0.001;0.8759±0.11247 vs 1.8729±0.17126,P0.001);(3)与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织中由M1型巨噬细胞分泌的MCP-1 (809.4061±87.58426 vs 3481.2152± 544.56428,P=0.004;756.0874±63.82350 vs 1839.9916±278.58902,P=0.011)、 IL-6 (876.3014±89.15848 vs 2994.8327±715.20988,P=0.031;767.2893± 101.21855 vs 1551.8582±279.99897,P=0.025)及TNFα(958.9250±171.21980 vs 2388.7611±336.02543,P=0.004;686.4714±75.95774 vs 1098.1217± 152.19985,P=0.036)等促炎症因子均显著增加;(4)与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织中由M2型巨噬细胞分泌的IL-10抗炎症因子显著增加(754.7814± 123.46827 vs 1344.0700±95.99649,P=0.004;852.1106±108.57063 vs 1222.1286 ±118.67813,P=0.044),但其增加程度低于促炎症因子;(5)与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织中M1型巨噬细胞诱导因子INFγ (859.2363±81.27950 vs 2438.2843± 441.08642,P=0.015;787.0618±73.38717 vs 1634.7678±303.67604,P=0.022)、M2型巨噬细胞诱导因子IL-4 (691.7181±49.64617 vs 1086.2468±122.75524,P=0.014;644.4628±69.21432 vs 996.8646±74.17361,P=0.006)与IL-13表达均显著增加(864.3688±103.17058 vs 1403.1810±172.13152,P=0.023;686.7570± 143.05874 vs 1126.0514±116.3674,P=0.038);但INFγ表达增加水平显著大于IL-4与IL-13;3.Gensini评分多元线性回归方程如下:Gensini评分=0.454×(心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值)+0.392×LDL-c、心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值(P=0.012)、LDL-c(P=0.028)进入回归方程,表明心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值与Gensini评分之间存在数量依存关系;心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值多元线性回归方程如下:心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值=0.631×空腹血糖+0.370×WC、空腹血糖(P0.001).WC(P=0.001)进入回归方程,表明空腹血糖、WC是影响心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值改变的临床因素;4.实时定量RT-PCR检测:与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织FAS mRNA表达水平显著增加(1.00000±0.00000 vs 3.71400±0.57180,P=0.029;1.00000±0.00000 vs 2.4557±0.44288,P=0.044), Perilipin(1.00000±0.00000 vs 0.55770±0.11265,P=0.017;1.00000±0.00000 vs 0.76250±0.10055,P=0.046).ATGL(1.00000±0.00000 vs 0.50700士0.10337, P=0.009;1.00000±0.00000 vs 0.64070±0.06643,P=0.006)及HSL(1.00000± 0.00000 vs 0.20020±0.05518,P0.0001;1.00000±0.00000 vs 0.60580±0.10979,P=0.023)的mRNA表达水平均显著降低,leptin mRNA表达水平显著增加(1.00000±0.00000 vs 5.53510±1.07432,P=0.013;1.00000±0.00000 vs 3.699030±0.52269,P0.0001),Adiponectin mRNA表达水平显著降低(1.00000 ±0.00000 vs 0.643±0.11482,P=0.021;1.00000±0.00000 vs 0.7205±0.10295, P=0.035);5.Western Blot检测:与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜、皮下脂肪组织IRS1(0.44120±0.06505 vs 0.21960±0.03455,P=0.013; 0.53570±0.08059 vs 0.29790±0.04345,P=0.027)与GLUT4(0.92950±0.07987 vs 0.64970±0.05241,P=0.015;1.01070±0.04565 vs 0.86180±0.03942,P=0.009)蛋白表达水平均显著降低,TRB3蛋白表达水平显著升高(0.68150±0.12607 vs1.15790±0.18196,P=0.035;0.48040±0.10520 vs 0.81890±0.09720,P=0.040),而PPARγ蛋白表达水平显著降低(0.93050±0.11089 vs 0.49890±0.04768, P=0.010;1.09010±0.09385 vs 0.75260±0.08006,P=0.021)。结论1.与单纯冠心病患者相比,合并糖尿病的冠心病患者心外膜脂肪组织中巨噬细胞含量,包括总的巨噬细胞、M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞均显著增加,巨噬细胞M1/M2比值显著增加,冠状动脉粥样硬化斑块病变程度更为严重;2.冠心病严重程度与心外膜脂肪巨噬细胞M1/M2比值具有数量依存关系;3.心外膜脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值在糖尿病加重冠脉病变进展过程中起着重要作用;4.合并糖尿病的冠心病患者心外膜与皮下脂肪组织TRB3蛋白表达显著增高,而PPARγ蛋白表达显著降低,提示TRB3/PPARγ信号通路可能在糖尿病加重冠心病进程中起着重要作用。背景糖尿病是冠心病的等危症已获得广泛共识,但糖尿病致动脉粥样硬化发生、发展及加重的具体机制尚不清楚。临床研究发现,2型糖尿病常合并肥胖,肥胖是糖尿病胰岛素抵抗与心血管并发症的独立危险因素。肥胖的流行与糖尿病及其心血管并发症发病率的增加息息相关。但目前仍缺乏有效的药物来治疗肥胖。Rajesh与Ajay Chawla的研究证实,激活免疫系统能够治疗肥胖和糖尿病。免疫系统与新陈代谢关系密切,脂肪组织中存在着大量的免疫细胞,这些细胞可以使脂肪组织炎症增加,促进脂肪组织功能紊乱,导致肥胖、糖尿病及心血管疾病等代谢疾病的发生发展。然而,脂肪组织炎症的具体形成机制尚不清楚。脂肪组织炎症表现可能来源于过度浸润的巨噬细胞。脂肪细胞能够分泌MCP-1等炎症因子,导致巨噬细胞的异常募集,两类细胞在肥胖患者脂肪组织中存在共区域化。然而,巨噬细胞分为促炎的M1型巨噬细胞及抗炎的M2型巨噬细胞;M2型巨噬细胞又细分为M2b及M2c型巨噬细胞。与单纯的巨噬细胞数目增多相比,脂肪组织巨噬细胞M1/M2比值的增加与脂肪功能紊乱更为密切相关。功能紊乱的脂肪细胞对巨噬细胞表型改变的影响尚不清楚。巨噬细胞M1/M2比值的增加导致促炎症因子表达增多,通过自分泌/旁分泌等信号阻断脂肪细胞胰岛素行为,促进脂肪细胞功能紊乱,加重胰岛素抵抗,脂肪细胞进一步增大,释放高水平的促炎症介质、进一步趋化巨噬细胞浸润,产生恶性循环。然而巨噬细胞表型改变的机制尚不清楚。PPARγ是核激素受体超家族成员之一,在脂肪组织中高度表达;巨噬细胞PPARγ基因敲除可以抑制巨噬细胞向M2型转化;PPARγ配体可以使高脂饮食诱导的M2b型巨噬细胞向M2a型转化。因此,我们认为PPARγ可能调节巨噬细胞表型改变。TRB3可以通过负调控PPARγ而抑制脂肪细胞分化,促进胰岛素抵抗。因此,我们推测TRB3/PPARγ可能通过调节巨噬细胞表型的改变参与了功能紊乱的脂肪细胞与活化巨噬细胞相互作用的恶性循环。本研究通过建立胰岛素抵抗的脂肪细胞,研究脂肪细胞对巨噬细胞M1/M2比值及巨噬细胞M2a/M2b型转化的影响,以及巨噬细胞M1/M2比值及巨噬细胞M2a/M2b型转化改变对脂肪细胞功能的影响,以确定功能紊乱脂肪细胞与巨噬细胞之间恶性循环的存在;并通过TRB3基因沉默确定TRB3是否打破了这种恶性循环,从而为肥胖、糖尿病及其心血管并发症的治疗提供新的靶点。目的1.建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型,确定功能紊乱的脂肪细胞对巨噬细胞M1/M2比值以及巨噬细胞M2a/M2b型间转化的作用;2.确定巨噬细胞M1/M2比值以及巨噬细胞M2a/M2b型间的转化对脂肪细胞功能的影响;3.通过TRB3基因沉默及应用PPARγ抑制剂确定TRB3/PPARy信号通路在脂肪细胞功能紊乱与巨噬细胞表型转化间相互影响中的作用。方法1.胰岛素抵抗脂肪细胞的建立:首先,应用胰岛素、地塞米松以及3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤将3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,然后,向分化成熟的脂肪细胞中加入高糖(25mM)+高胰岛素(10nM)刺激,继续培养24h,建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型;2.M2a型巨噬细胞诱导分化:采用含20ng/ml的M-CSF、20ng/ml的IL-4 RPMI 1640完全培养基诱导分化Raw264.7巨噬细胞4天;3. Elisa检测:获取脂肪细胞上清,检测脂肪细胞上清中INFγ、IL-4及IL-13的表达水平;4.脂肪细胞上清刺激巨噬细胞:分别获取正常脂肪细胞与胰岛素抵抗脂肪细胞的上清,将上清刺激巨噬细胞48h;5.脂肪细胞与巨噬细胞共培养:采用transwell小室(6孔,直径0.4μm),将脂肪细胞种于transwell小室上层,将转染TRB3空载体或TRB3基因沉默的巨噬细胞种于transwell小室下层,共培养48h;6.流式细胞学检测:M1型巨噬细胞(CD11c阳性细胞)与M2型巨噬细胞(CD206阳性细胞)所占比例;7.实时定量RT-PCR检测:获取刺激后的巨噬细胞,提取RNA,实时定量荧光RT-PCR检测肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素10(IL-10)、MR及Dectin-1 mRNA表达水平。8.巨噬细胞功能的检测:获取巨噬细胞,检测巨噬细胞的粘附、迁移及吞噬功能;9. Western Blot检测:获取共培养后的脂肪细胞,提取蛋白质,Western Blot检测脂肪合成酶(FASN)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂肪酶(HSL)、葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)以及胰岛素受体底物1(IRS-1)的蛋白表达量;结果1.胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立:与0h相比,高糖加高胰岛素刺激脂肪细胞24h后,脂肪细胞的IRS-1蛋白水平明显降低(0.6783±0.11294 vs0.2465±0.0796,P0.01);与Oh相比,高糖加高胰岛素刺激脂肪细胞24h后,脂肪细胞胞膜的GLUT4水平明显降低(1.00±0.00 vs 0.4318±0.09309,P0.01),而脂肪细胞胞浆的GLUT4水平明显增多(1.00±0.00 vs 1.7673±0.0975,P0.001)。结果提示,高糖加高胰岛素刺激条件下,脂肪细胞IRS-1蛋白水平与糖转运明显减少,出现胰岛素抵抗。2.脂肪细胞上清刺激巨噬细胞(1)脂肪细胞上清中巨噬细胞分化诱导因子的改变:与正常脂肪细胞相比,胰岛素抵抗脂肪细胞上清的M1型巨噬细胞诱导因子INFγ显著增加(27.9833±3.7226 vs 76.0333±5.85172,P0.01),M2型巨噬细胞诱导因子IL-4、IL-13也显著增加(3.02±0.078156 vs 7.63±0.20518, P0.05; 14.1567±0.32271 vs 21.5367±0.54229, P0.001),但是INFγ增加程度更为明显,INFγ/IL-13比值显著增加(1.9671±0.21447 vs 3.863±0.23059,P0.001)。结果提示,胰岛素抵抗脂肪细胞可能参与了巨噬细胞M1型与M2型之间的转化。(2)脂肪细胞上清诱导巨噬细胞表型改变:与正常脂肪细胞上清刺激相比,胰岛素抵抗脂肪细胞上清刺激显著增加巨噬细胞M1/M2比值(1.1425±0.18347vs 5.3525±0.41085,P0.01)。(3)脂肪细胞上清诱导巨噬细胞功能的改变:与正常脂肪细胞上清刺激相比,胰岛素抵抗脂肪细胞上清刺激巨噬细胞后巨噬细胞粘附功能明显增加(15.3333±2.02759 vs 55.0000±5.2915,P0.01),迁移功能明显增加(24.6667±4.91031 vs 124.3333±13.01708,P0.01),吞噬功能明显增加(14.7267±6.96525vs 48.4667±4.90453,P0.05)。3.脂肪细胞与巨噬细胞共培养(1)脂肪细胞与Raw264.7巨噬细胞共培养:与正常脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养组巨噬细胞M1/M2比值显著增加(1.4236±0.24252 vs 5.8494±0.1611,P0.05);与正常脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养组巨噬细胞粘附功能显著增加(19.6667±1.45297 vs55.3333±6.35959,P0.05);巨噬细胞迁移功能显著增加(27.3333±6.00925 Vs140.3333±15.60271,P0.05);巨噬细胞吞噬功能显著增加(10.56±3.54056 vs57.4667±3.92825,P0.05)。(2)脂肪细胞与M2a型巨噬细胞共培养:与正常脂肪细胞相比,胰岛素抵抗脂肪细胞与M2a型巨噬细胞共培养导致了巨噬细胞TNFαmRNA表达显著增加(1.0000±0.00000 vs 10.1741±0.54125,P0.05),巨噬细胞IL-10 mRNA表达显著增加(1.0000±0.00000 vs 9.8212±1.45653,P0.05),巨噬细胞MR mRNA表达水平显著下调(1.0000±0.00000 vs 0.1085±0.01546,P0.05),巨噬细胞Dectin-1 mRNA表达水平显著下调(1.0000±0.00000 vs 0.0559±0.02036,P0.05),在胰岛素抵抗脂肪细胞与M2a型巨噬细胞共培养中并未检测到M1型巨噬细胞所特有的IL-23mRNA的表达。结果提示,胰岛素抵抗的脂肪细胞并未促进M2a型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,而是促进了巨噬细胞由M2a状态(TNFαlow, IL-10low,MRhigh,Dectin-1high)向M2b状态(LNFαhigh,IL-10high,MR,Dectin-1)转化。与正常脂肪细胞相比,胰岛素抵抗脂肪细胞与M2a型巨噬细胞共培养导致了巨噬细胞粘附功能显著增加(14.6667±1.45297 vs 29.0000±5.2915,P0.05),巨噬细胞迁移功能显著增加(8.6667±1.76383 vs 28.0000±3.4641,P0.05),巨噬细胞吞噬功能无显著统计学意义(86.13±5.464 vs 96.87±0.94,P0.05)。(3)巨噬细胞M1/M2比值增加对脂肪细胞功能的影响:与正常脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养在增加巨噬细胞M1/M2比值的同时,脂肪细胞FASN蛋白水平显著增加(0.2886±0.05638 vs 0.6524±0.01138,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著降低(0.3015±0.04058 vs 0.0928±0.00907,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著降低(0.7425±0.0442 vs 0.3727±0.03422,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著降低(0.7351±0.07402 vs 0.3363±0.02335,P0.05)。结果提示,巨噬细胞M1/M2比值的增加促进了脂肪细胞胰岛素抵抗与功能紊乱。(4)巨噬细胞M2a/M2b表型转化对脂肪细胞功能的影响:与正常脂肪细胞与TRB3空载体M2a巨噬细胞共培养组相比,胰岛素抵抗脂肪细胞与TRB3空载体M2a型巨噬细胞共培养在促进巨噬细胞M2a向M2b状态转化的同时,脂肪细胞FASN蛋白水平显著增加(0.3224±0.02885 vs 0.5285±0.07128,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著降低(0.306±0.033336 vs 0.1462±0.03311,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著降低(0.7043±0.03063 vs 0.2392±0.03717,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著降低(0.6836±0.02287 vs 0.3302±0.01423,P0.05);结果提示,巨噬细胞M2a向M2b状态转化促进脂肪细胞功能紊乱与胰岛素抵抗。2.TRB3基因沉默及PPARγ抑制剂对巨噬细胞表型转化及脂肪细胞功能的影响(1)TRB3基因沉默对巨噬细胞M1/M2比值及脂肪细胞功能的影响:与胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默巨噬细胞共培养导致巨噬细胞M1/M2比值显著降低(5.38494±0.1611vs 2.7752±0.1482,P0.05)。与胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默巨噬细胞共培养导致脂肪细胞FASN蛋白水平显著降低(0.6524+0.01138 vs 0.4978±0.02013,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著增加(0.0928±0.00907 vs 0.2284±0.02413,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著增加(0.3727±0.0342 vs 0.6234+0.03253,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著增加(0.3363±0.02335 vs 0.5457±0.049,P0.05);结果提示,巨噬细胞TRB3基因沉默在显著降低巨噬细胞M1/M2比值的同时,改善了脂肪细胞功能紊乱与胰岛素抵抗。(2)TRB3基因沉默对巨噬细胞M2a/M2b表型转化及脂肪细胞功能的影响:与胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3空载体M2a巨噬细胞共培养组相比,胰岛素抵抗脂肪细胞与TRB3基因沉默的M2a型巨噬细胞共培养导致了巨噬细胞TNFα mRNA表达显著降低(10.1741±0.54125 vs 4.078±0.32861,P0.05),巨噬细胞IL-10 mRNA表达显著降低(9.8212±1.45653 vs 4.9922±0.52921,P0.05),巨噬细胞MR mRNA表达水平显著增加(0.1085±0.01546 vs 0.3037±0.05341,P0.05),巨噬细胞Dectin-1 mRNA表达水平显著增加(0.0559±0.02036 vs0.4244±0.03933,P0.05)。结果提示,TRB3基因沉默降低了巨噬细胞由M2a型向M2b型转化。与胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3空载体M2a巨噬细胞共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞与TRB3基因沉默的M2a型巨噬细胞共培养组脂肪细胞FASN蛋白水平显著降低(0.5285±0.07128 vs 0.3591±0.03328,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著增加(0.1462±0.03311 vs 0.2508±0.02857,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著增加(0.2392±0.03717 vs 0.3945±0.06253,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著增加(0.3302±0.01423 vs 0.4754±0.03142,P0.05)。结果提示,TRB3基因沉默在抑制巨噬细胞M2a向M2b状态转化的同时,改善了脂肪细胞功能紊乱与胰岛素抵抗。(3) PPARγ抑制剂对巨噬细胞M1/M2比值及脂肪细胞功能的影响:与胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默+GW9662共培养显著增加了巨噬细胞M1/M2比值(2.7752±0.1482 vs4.65±0.27095,P0.05)。结果提示,PPARγ抑制剂逆转了TRB3基因沉默导致的巨噬细胞M1/M2比值的减少。与胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默共培养相比,胰岛素抵抗脂肪细胞+TRB3基因沉默+GW9662共培养在显著增加巨噬细胞M1/M2比值的同时,脂肪细胞FASN蛋白水平显著增加(0.3564±0.0451 vs 0.6689±0.04726,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著降低(0.709±0.06562 vs 0.4023±0.07475,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著降低(0.7144±0.05866 vs 0.3132±0.10777,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著降低(0.9044±0.09809 vs 0.6102+0.03064,P0.05)。结果提示,PPARγ抑制剂逆转了TRB3基因沉默导致的脂肪细胞功能改善。(4) PPARγ抑制剂对巨噬细胞M2a/M2b表型转化及脂肪细胞功能的影响:与胰岛素抵抗脂肪细胞与TRB3基因沉默的M2a型巨噬细胞共培养相比,PPARγ抑制剂GW9662导致了巨噬细胞TNFαmRNA表达显著增加(1.0000±0.00000 vs3.6803±0.18148,P0.05),巨噬细胞IL-10mRNA表达显著增加(1.0000±0.00000vs 3.3744±0.64555,P0.05),巨噬细胞MRmRNA表达显著降低(1.0000±0.00000vs 0.2635±0.03888,P0.05),巨噬细胞Dectin-1 mRNA表达显著降低(1.0000±0.00000 vs 0.4154±0.04681,P0.05)。结果提示,PPARγ抑制剂逆转了TRB3基因沉默导致的巨噬细胞M2a向M2b状态转化的减少。与胰岛素抵抗脂肪细胞与TRB3基因沉默的M2a型巨噬细胞共培养相比,PPARγ抑制剂GW9662导致子脂肪细胞FASN蛋白水平显著增加(0.2906±0.0402vs 0.4728±0.02693,P0.05),脂肪细胞ATGL蛋白水平显著降低(0.725±0.03671vs 0.3835±0.04293,P0.05),脂肪细胞HSL蛋白水平显著降低(1.0795±0.11401vs 0.7006±0.05019,P0.05),脂肪细胞IRS-1蛋白水平显著降低(0.6893±0.01518vs 0.3655±0.06295,P0.05)。结果提示,PPARγ抑制剂逆转了TRB3基因沉默导致的脂肪细胞功能改善。。3.TRB3与PPARγ相互作用:胰岛素抵抗脂肪细胞上清刺激巨噬细胞后,随着时间延长,与0h相比,在12h、24h及48h巨噬细胞TRB3蛋白水平表达显著增加(0.6437±0.04636 vs 0.7816±0.03266 vs 1.0100±0.0975 vs 1.2375±0.08942,P0.05);胰岛素抵抗脂肪细胞上清刺激巨噬细胞后,随着时间延长,与0h相比,在24h及48h巨噬细胞PPARy蛋白水平表达显著降低(0.3363±0.02182 vs 0.3929±0.01287 vs 0.1844±0.011,P0.05);免疫共沉淀结果显示,与正常脂肪细胞上清刺激相比,胰岛素抵抗脂肪细胞上清刺激巨噬细胞后,TRB3与PPARγ蛋白结合显著增加;共培养结果显示,与胰岛素抵抗脂肪细胞+空载体巨噬细胞共培养相比,TRB3基因沉默在降低巨噬细胞M1/M2比值的同时,可显著增加PPARγ蛋白水平(0.1762±0.02853 vs 0.28829±0.00807,P0.05)。结果提示,TRB3/PPARγ信号通路可能参与了巨噬细胞极化的调节。结论1.胰岛素抵抗脂肪细胞促进巨噬细胞M1/M2比值的增加及巨噬细胞由M2a型向M2b型的转化;2.巨噬细胞M1/M2比值的增加及巨噬细胞由M2a型向M2b型的转化促进脂肪细胞功能紊乱;3.TRB3基因沉默通过抑制巨噬细胞M1/M2比值的增加及巨噬细胞由M2a型向M2b型的转化,改善脂肪功能紊乱;4. TRB3/PPARγ信号通路在脂肪细胞诱导的巨噬细胞极化过程中起着重要作用;背景流行病学研究显示,全球糖尿病正以惊人的速率增长,直到2030年中国将成为糖尿病人口最多的两个国家之一。糖尿病是包括动脉粥样硬化性心脏病在内的多种疾病的危险因素。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征。脂肪组织是胰岛素抵抗产生的始发部位。因此,丞需探索糖尿病脂肪组织胰岛素抵抗发生发展的深层次机制,为治疗糖尿病相关疾病提供可靠的理论依据。脂肪组织与胰岛素抵抗密切相关,脂肪组织分为白色脂肪与棕色脂肪组织,以往主要单独研究各类脂肪组织对胰岛素抵抗的作用,并没有对同一机体不同部位的脂肪组织对胰岛素抵抗的作用进行比较。白色脂肪组织分为内脏与皮下脂肪组织,相比而言,内脏脂肪与胰岛素抵抗关系更为密切。研究证实棕色脂肪亦与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素抵抗的产生与脂肪组织中促炎症因子与抗炎症因子的失衡有关,而决定炎症因子表达的是脂肪组织中促炎症的M1型巨噬细胞与抗炎症的M2型巨噬细胞的平衡。但脂肪组织巨噬细胞极化的机制并不清楚。STAMP2,是一种六次跨膜蛋白,属于STAMP或STEAP家族。STAMP2具有调节炎症与胰岛素抵抗的作用。Wellen研究发现,在STAMP2敲除的小鼠,内脏脂肪STAMP2的缺乏要比皮下脂肪显著,而棕色脂肪中STAMP2的表达量未有报道。研究亦发现,STAMP2缺乏可以增加脂肪组织中巨噬细胞的浸润,但与巨噬细胞极性转化的关系并不清楚。为了研究STAMP2对糖尿病小鼠不同部位脂肪组织中炎症与巨噬细胞的影响,我们构建了2型糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠模型,体内应用STAMP2腺病毒过表达,检测STAMP2对各脂肪组织中巨噬细胞浸润、极化、炎症因子表达及信号通路的影响,探讨在糖尿病状态下,STAMP2可能通过调节不同脂肪组织中巨噬细胞的极化而作为整合炎症与胰岛素抵抗的枢纽,改善能量与代谢平衡。目的1.探讨2型糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠不同部位脂肪组织中STAMP2表达量的改变;2.探讨2型糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠不同部位脂肪组织中巨噬细胞数量、M1/M2型巨噬细胞比例的不同;3.探讨STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠不同部位脂肪组织中巨噬细胞数量、M1/M2型巨噬细胞比例的影响。方法1.建立2型糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠模型:将32只3周龄小鼠随机分为对照组(n=16)与高脂饮食组(n=16),高脂饮食组高脂喂养6周后,经糖耐量实验证实出现胰岛素抵抗的腹腔注射STZ,再高脂喂养2周,至小鼠11周龄时再行腹腔糖耐量实验(IPGTT),随机血糖≥11.1mmol/l的小鼠入组为糖尿病组;2.实验动物分组:在ApoE-/-/LDLR-/-小鼠20周龄时,将对照组分为对照+STAMP2空载体组、对照+STAMP2过表达组、糖尿病+STAMP2空载体组、糖尿病+STAMP2过表达组;3.IPGTT试验:小鼠空腹10-16h,按照2g/kg体重腹腔注射葡萄糖,然后于0min、15 min、30 min、60 min和120 min分别断尾取血检测血糖;4.定时监测ApoE-/-/LDLR-/-小鼠体重;5.病理学检测:对附睾、皮下及棕色脂肪组织分别进行HE染色;通过免疫组织化学染色的方法检测脂肪组织内巨噬细胞总量(F4/80)、M1型巨噬细胞(CDl1c)、M2型巨噬细胞(CD206)的含量,计算巨噬细胞M1/M2的比值;通过免疫组织化学染色的方法检测脂肪组织内促炎症因子单核细胞趋化因子1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及白介素6(IL-6)与抗炎症因子白介素10(IL-10)的表达水平;油红O染色确定肝脏组织脂质含量;6.Western Blot检测:取新鲜附睾、皮下及棕色脂肪组织,提取蛋白质,Western Blot检测脂肪组织STAMP2、p-JNK以及JNK蛋白表达水平。7.结果1.建立2型糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠模型:(1)IPGTT实验显示,3周龄时对照组与糖尿病组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠在血糖水平无显著统计学差异(P均0.05);高脂饮食6周后,与对照组ApoE-/-/ LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠在15min.30min.60min及120min血糖水平显著增加,血糖曲线下面积显著增加(P均0.05);11周龄时,与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠在Omin、15min、 30min、60min及120min血糖水平显著增加,血糖曲线下面积显著增加(P均0.05);(2)与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠在9周龄(23.2400±0.57651 vs 26.5867±0.73055,P=0.001)、20周龄(26.8333±0.62272 vs 30.5133±0.70855,P=0.001)、22周龄(26.51±0.49226 vs 29.57±0.63317,P0.0010及24周龄(25.81±0.68936 vs 28.40±0.47352,P=0.002)时体重显著增加。2.ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂肪组织STAMP2表达情况(1)与对照组A-poE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾、棕色脂肪组织中内源性STAMP2蛋白表达水平显著降低(0.9596±0.0268 vs 0.5416±0.06812,P=0.002;1.0120±0.10051 vs 0.6134±0.03813,P=0.004),皮下脂肪组织中内源性STAMP2蛋白表达水平无显著统计学差异(0.0214±0.00474 vs 0.0162±0.00151,P0.05);(2)与对照+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,对照+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中STAMP2蛋白表达水平显著增加(0.9596±0.0268 vs 1.2114±0.04363,P=0.019;1.0120±0.10051 vs 1.1233 ±0.05992,P=0.020),皮下脂肪组织中STAMP2蛋白表达水平无显著统计学差异(0.0214±0.00474 vs 0.0271±0.00729,P0.05);(3)与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中STAMP2蛋白表达水平显著增加(0.5416±0.06812 vs 0.7783±0.09189,P=0.028;0.6134± 0.03813 vs 0.8475±0.06312,P=0.044),皮下脂肪组织中STAMP2蛋白表达水平无显著统计学差异(0.0162±0.00151 vs 0.0189±0.00197,P0.05);4.STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂肪组织形态学影响:(1)与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与皮下脂肪细胞均显著增大,棕色脂肪组织出现大的脂质空泡,有棕色脂肪白色变现象。(2)与对照+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,对照+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾脂肪细胞显著减小,皮下脂肪细胞大小无显著性差异,棕色脂肪组织中脂质空泡显著减小,逆转棕色脂肪白色变现象。(3)与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾脂肪细胞显著减小,皮下脂肪细胞大小无显著性差异,棕色脂肪组织中脂质空泡显著减小,逆转棕色脂肪白色变现象。5.STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润与极化改变的影响:(1)与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾、皮下及棕色脂肪组织中巨噬细胞浸润显著增加,巨噬细胞M1/M2比值显著增加(0.45±0.02 vs 3.22±0.81,P0.05;0.162±0.017 vs 2.65±0.071,P0.05;0.312 ±0.014 vs 2.87±0.32,P0.05);(2)与对照+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,对照+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中巨噬细胞浸润显著减少,M1/M2比值显著减少(0.45±0.02 vs 0.17±0.01,P0.05;0.312±0.014 vs 0.111 ±0.017,P0.05),皮下脂肪组织中巨噬细胞浸润与巨噬细胞M1/M2比值无显著统计学差异(0.162±0.017 vs 0.143±0.028,P0.05);(3)与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中巨噬细胞浸润显著减少,M1/M2比值显著减少(3.22±0.81 vs 1.97±0.21,P0.05;2.87±0.32 vs 1.125±0.191,P0.05),皮下脂肪组织中巨噬细胞浸润及巨噬细胞M1/M2比值无显著统计学意义(2.65±0.071 vs 2.14±0.0613,P0.05);6.STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂肪组织炎症表达的影响:(1)与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾、皮下及棕色脂肪组织中MCP-1(0.0097±0.0012 vs 0.1179±0.0278,P0.05; 0.0271±0.00415 vs 0.1113±0.01798,P0.05;0.0041±0.0008 vs 0.0972±0.0127, P0.05)、IL-6(0.0192±0.00474 vs 0.1148±0.02501,P0.05;0.0251±0.00315 vs 0.1458±0.03405,P0.05;0.0247±0.00948 vs 0.0811±0.01824,P0.05)、 TNFα(0.0152±0.00293 vs 0.1428±0.0168,P0.05;0.0196±0.00176 vs 0.1255 ±0.02125,P0.05;0.0017409±0.003534 vs 0.063732±0.007889,P0.05)及 IL-10 (0.0128±0.0012 vs 0.0421±0.0092,P0.05;0.0019±0.0003 vs 0.0247± 0.0075,P0.05;0.0067±0.0001 vs 0.0311±0.0014,P0.05)均显著增加,但抗炎症因子IL-10增加程度低于促炎症因子MCP-1、IL-6及TNFα;(2)与对照+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,对照+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中促炎症因子MCP-1(0.0097±0.0012 vs 0.0063±0.0014,P0.05;0.0041±0.0008 vs 0.0028± 0.0002,P0.05)、IL-6 (0.0192±0.00474 vs 0.0164±0.00347,P0.05;0.0247 ±0.00948 vs 0.0207±0.00375,P=0.002)及TNFα(0.0152±0.00293 vs 0.0084± 0.0012,P0.05;0.0017409±0.003534 vs 0.0028±0.001868,P0.05)显著减少,抗炎症因子IL-10显著增加(0.0128±0.0015 vs 0.0293±0.0092,P0.05;0.0067 ±0.0001 vs 0.0102±0.0002,P0.05),皮下脂肪组织中炎症因子表达无显著统计学意义;(3)与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中促炎症因子MCP-1(0.1179±0.0278 vs 0.0723±0.0089,P0.05;0.0972±0.0127 vs 0.0423± 0.0098,P0.05)、IL-6 (0.1148±0.02501 vs 0.0486±0.00519,P0.05;0.0811 ±0.01824 vs 0.0547±0.00472,P0.05)及TNFα (0.1428±0.0168 vs 0.0976±0.0172,P0.05;0.063732±0.007889 vs 0.040171±0.004773,P0.05)显著减少,抗炎症因子IL-10显著增加(0.0421±0.0092 vs 0.057±0.0139,P0.05;0.0311 ±0.0014 vs 0.0392±0.0105,P0.05),皮下脂肪组织中炎症因子表达无显著统计学意义;7.STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠糖耐量实验的影响:(1)在实验末,与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠及糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠体重均显著增加(P均0.05);与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠体重无显著统计学意义(P0.05)。(2)IPGTT实验显示,与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠在Omin、15min、30min、60min及120min血糖水平显著降低,血糖曲线下面积显著降低(P均0.05)。结果提示,STAMP2过表达改善了糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠胰岛素抵抗状态。8.STAMP2过表达对ApoE-/-/LDLR-/-小鼠肝脏脂质沉积的影响:与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠及糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂质沉积显著增加(2.63±0.59 vs 7.00±1.7,P0.05;2.63±0.59 vs 5.21±0.8,P0.05);与糖尿病+STAMP2空载体组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠脂质沉积显著减少(7.00±1.7 vs 5.21±0.8,P0.05)。9.STAMP2过表达抑制了JNK信号通路与糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾脂肪组织中p-JNK/JNK降低了55%;与糖尿病A-poE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠棕色脂肪组织中p-JNK/JNK降低了54.6%。结论1.与对照组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/-/LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中STAMP2表达水平显著降低,皮下脂肪组织STAMP2表达水平无显著统计学意义;2.STAMP2过表达可显著降低附睾与棕色脂肪组织中巨噬细胞总量及巨噬细胞M1/M2比值,相应地,促炎症因子表达减少,抗炎症因子表达增加;3.STAMP2过表达可通过影响巨噬细胞极化改善糖尿病ApoE-/-/LDLR-/-小鼠胰岛素抵抗。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R587.1;R541.4

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