几种商品化糖胺聚糖降解酶的克隆表达及其应用

【摘要】：糖胺聚糖(GAGs)又称为粘多糖,是聚阴离子杂多糖的一种,主要存在于结缔组织中,是一种线性的生物大分子,按照其二糖组成不同可以分为硫酸软骨素／硫酸皮肤素(CS/DS)、肝素／硫酸乙酰肝素(HP/HS)及透明质酸(HA)等。GAGs在各种生命过程中发挥着重要的功能,包括：抗凝活性、神经系统修复、调节细胞信号转导等。目前肝素主要从猪小肠粘膜中提取,提取过程中会产生大量的副产物,即类肝素(HPND),主要是HS/HP、DS和少量的CS。由于HPND中各种GAGs的理化性质极为相似,很难将它们相互分离,实现高值化利用。舒洛地特(SLDX)是一种由HS/HP和DS组成的抗血栓药物,由于其抗栓效果好,副作用小,被广泛使用,但目前完全依赖进口,价格昂贵。本研究我们将通过克隆表达一系列高活力商品化GAGs降解酶,用以从HPND中纯化HS/HP,并结合分级沉淀的方法,探索SLDX的仿制工艺,并初步比较了仿制药与原研药的生物活性。具体如下：1. GAGs降解酶的克隆表达与纯化：本研究以Flavobacterium heparinum基因组为模板,通过基因扩增,表达载体构建,菌株诱导以及蛋白表达与纯化得到三种蛋白,分别为：肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中：肝素酶Ⅰ的表达量为300-320 mg/L,酶活为90-100 IU/mg；肝素酶Ⅲ的表达量为240-260 mg/L,酶活为80-90 IU/mg。从Proteus vulgaris NCTC 4636菌株中纯化硫酸软骨素酶ABC,酶活为4000 IU/L。从本实验室发现的菌株Vibrio sp. FC509克隆表达HCLase,其对HA的酶活为450,000 IU/mg,对CS的酶活为330,000 IU/mg。2. SLDX的分析及仿制：分子量分析与及二糖组成分析实验表明,SLDX的分子量分布范围很宽,主要含有HS/HP (～80%)和DS(-20%)。HS/HP二糖中主要含有6种类型的二糖结构。其中三硫酸化二糖(HexUA(2S)-GlcN(NS,6S))以及非硫酸化二糖(HexUA-GlcNAc)比例最高,分别为38.03%与19.35%。DS则主要由HexUA1-3 GalNAc(4S)组成。据此,我们利用生物酶法从HPND纯化得到高纯度的HP以及HS,并结合HPND的沉淀分级,探讨了SLDX的仿制工艺,初步仿制了SLDXo3.仿制药与SLDX的生物活性比较：抗FⅡa与FXa因子实验表明,SLDX的抗FXa与FⅡa活性分别为74.23 IU/mg与60.54 IU/mg,仿制药的抗FXa与FⅡa值分别为62.29 IU/mg与58.11 IU/mg, SLDX的FXa/FIIa为1.22,仿制药为1.07。大鼠体内促LPL释放活性实验表明：SLDX的促LPL释放活性为174.3 mU/ml,仿制药为164.9 mU/ml。综上所述,本课题成功克隆表达和纯化了多个具有重要应用价值的高活性GAGs降解酶,并在此基础上,以HPND为原料,探讨了抗血栓药舒络地特的仿制工艺,初步制得了在组成和活性上与原研药相似的仿制品。