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《山东大学》 2015年
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AEG-1/MT qDH、NF-κB、MMP-9在胃癌中的表达及相关性的研究

黄勇  
【摘要】:研究背景胃癌是主要恶性肿瘤之一,居全球常见肿瘤的第二位,胃癌占全球肿瘤死亡的最常见原因的第二位。我国胃癌的发病人数及死亡人数均占全球胃癌发病总人数50%左右,我国的胃癌呈现发病率和病死率高、早期胃癌少、进展期病例居多等特点,严重威胁国民的身心健康。胃癌起源于胃粘膜上皮细胞,大量研究证实胃癌发生是进行性发展的多因素及多步骤过程;特征性的多种基因差异表达存在于从正常的胃粘膜到癌前病变直至胃癌发生的全过程中。星形细胞上调基因-1(Astrocyte elevated gene-1, AEG-1),也被称为异粘蛋白(Metadherin, MTDH)或LYRIC (Lysine-rich CEACAM1 co-isolated),于2002年首先由Su ZZ等克隆出来,随后Kang DC等描述了其全长及功能。近年来,大量研究支持AEG-1/MTDH在癌症发展中扮演着重要的角色,其在肿瘤的转化、凋亡逃避、侵袭、血管生成及转移等多个方面发挥关键作用,其在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、食管癌等多种恶性肿瘤中高表达,并且与这些肿瘤的进展和临床不良预后相关。但AEG-1/MTDH与胃癌临床病理特征的研究目前还不多见,而且研究结果还有争议。核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)能调控多种基因转录表达,进而调节凋亡及细胞增殖,从而促进肿瘤血管发生、转移及侵袭等生物学行为。越来越多的研究提示NF-κB与癌症密切相关,其在癌症的发生、发展中发挥着关键作用。在胃癌组织及胃癌细胞中NF-κB高表达,并组成性激活,其激活与细胞侵袭、新生血管形成及癌细胞抵抗凋亡有关,还涉及胃癌发生、发展、浸润、转移、治疗、预防和预后等诸多方面。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族中分子量最大的酶是基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9), MMP-9以酶原形式分泌,其激活后形成Ⅳ型胶原酶,可降解基底膜和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的构成蛋白,进而破坏肿瘤细胞周围的ECM,与肿瘤的转移及侵袭有关。近年来,研究显示MMP-9高表达与胃癌的转移及浸润密切相关。在Hala细胞中AEG-1/MTDH可诱导的NF-κB激活,AEG-1/MTDH是NF-κB重要的正调节蛋白。AEG-1/MTDH通过增加MMP-9的转录,进而促进肿瘤细胞侵袭,从而促进胶质瘤的进展。生长因子、细胞因子及原癌基因等,通过作用于MMP-9基因的启动子含有的活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)、NF-κB等结合位点,诱导MMP-9的表达。胃癌组织中AEG-1/MTDH的表达情况及其表达与临床病理特征的关系,目前研究结果仍有争议,仍需要进一步研究证实,而且胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达的相互关系,目前国内外尚缺少相应研究。而采用慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH的表达,对胃癌细胞株SGC7901的增殖及迁移的影响,及胃癌细胞中AEG-1/MTDH、NF-κB、 MMP-9信号通路的相关研究极少。本课题旨在进一步探讨胃癌中AEG-1/MTDH的表达及其临床意义,并探寻胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达的相互关系,以及研究胃癌细胞中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9信号通路情况,探寻提高胃癌治疗效果的新的特异性靶分子。本课题进行了以下三部分研究:第一部分即胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达情况及临床意义,以及胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达的相互关系;第二部分即检测AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9在胃癌组织及区域转移淋巴结中的表达情况及其临床意义;第三部分即探讨慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH表达对胃癌细胞株SGC7901细胞增殖及迁移的影响,并探讨胃癌细胞中AEG-1/MTDH、NF-kB. MMP-9信号通路情况。第一部分:胃癌组织AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9的表达情况及其临床意义[研究目的]探讨AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌临床病理特征的关系,探寻胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达相互关系。[研究方法]采用免疫组织化学法检测84例胃癌患者AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9表达情况,观察三个指标之间的相互关系及其与患者临床病理特征及预后的关系。[结果]1.胃癌组织中AEG-1/MTDH阳性表达的PU (positive unit, PU)值明显高于癌旁组织,其阳性表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P0.05),分’化程度越低、TNM分期越高,AEG-1/MTDH阳性表达的PU值越高,但其阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、Lauren分型无关;生存曲线显示AEG-1/MTDH阴性表达患者生存期显著长于阳性表达者。2.胃癌组织中NF-κB阳性表达的PU值明显高于癌旁组织,其阳性表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关(P0.05),分化程度越低、浸润深度越深、TNM分期越高,NF-κB阳性表达的PU值越高,但其阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、Lauren分型无关;生存曲线显示NF-κB阴性表达患者生存期显著长于阳性表达者。3.胃癌组织中MMP-9阳性表达的PU值明显高于癌旁组织,其阳性表达与浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关(P0.05),浸润深度越深、TNM分期越高,MMP-9阳性表达的PU值越高,但其阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、Lauren分型无关;生存曲线显示MMP-9阴性表达患者生存期显著长于阳性表达者。4.胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB阳性表达呈正相关,NF-κB、MMP-9呈正相关,AEG-1/MTDH、MMP-9阳性表达亦呈正相关。5.COX回归分析模型单因素分析显示,分化程度、临床TNM分期、淋巴结转移及AEG-1/MTDH表达是显著影响胃癌术后生存率的指标(P0.05),无显著影响的指标有:年龄、性别、浸润程度、NF-κB表达及MMP-9表达(P0.05)。COX回归分析模型多因素分析显示,AEG-1/MTDH表达、淋巴结是否转移及临床TNM分期是影响胃癌术后生存率的指标中最为重要的三个指标。生存曲线显示AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9三阴性表达患者生存期显著长于三阳性表达者(P0.05)。[结论]1.胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9阳性表达的PU值均明显高于癌旁组织,并且与胃癌的临床病理特征相关。2. AEG-1/MTDH可能通过调控NF-κB、MMP-9的表达来参与胃癌的发生、发展及浸润、转移。3.检测胃癌组织中AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9的表达,有助于胃癌发生、发展及浸润、转移的判断并有利于胃癌预后的评价,可能作为评估胃癌病情进展的辅助指标之一,并可能作为胃癌分子治疗的新靶点。第二部分:AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP一9在胃癌组织及区域转移淋巴结中的表达及临床意义[研究目的]探讨AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9在胃癌及区域转移淋巴结中的表达情况及其临床意义。[研究方法]采用免疫组织化学法检测64例胃癌及第一站淋巴结转移患者AEG-1/MTDH、 NF-κB及MMP-9表达情况,观察在胃癌及区域转移淋巴结中三个指标之间的相互关系及其与临床病理特征的关系。[结果]1.AEG-1/MTDH在第一站淋巴结转移灶中的阳性表达率明显高于胃癌原发灶中的阳性表达率(P0.05),胃癌原发灶中AEG-1/MTDH的表达与淋巴结转移灶中AEG-1/MTDH的表达呈正相关(r=0.432,P=0.000)。胃癌淋巴结转移灶AEG-1/MTDH阳性表达与分化程度有关(P0.05),但其阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小及部位、浸润深度、Lauren分型及TNM分期无关。2. NF-κB在第一站淋巴结转移灶中的阳性表达率明显高于胃癌原发灶中的阳性表达率(P0.05),胃癌原发灶中NF-κB的表达与淋巴结转移灶中NF-κB的表达呈正相关(r=0.372,P=0.002)。胃癌淋巴结转移灶NF-κB阳性表达与TNM分期有关(P0.05),但其阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小及部位、分化程度、浸润深度及Lauren分型无关。3.MMP-9在第一站淋巴结转移灶中的阳性表达率明显高于胃癌原发灶中的阳性表达率(P0.05),胃癌原发灶中MMP-9的表达与淋巴结转移灶中MMP-9的表达呈正相关(r=0.422,P=0.001)。胃癌淋巴结转移灶MMP-9阳性表达与胃癌的性别、年龄、肿瘤大小及部位、分化程度、浸润深度、Lauren分型及TNM分期均无关。4.胃癌原发灶及淋巴结转移灶中AEG-1/MTDH、NF-κB阳性表达呈正相关,NF-κB、MMP-9呈正相关,AEG-1/MTDH、MMP-9阳性表达亦呈正相关性。5.生存曲线显示胃癌淋巴结转移灶AEG-1/MTDH阴性表达患者生存期明显长于其阳性表达者(P=0.035)。然而生存曲线显示胃癌淋巴结转移灶NF-κB及MMP-9阴性表达患者生存期虽然稍长于NF-κB及MMP-9阳性表达者,但差别无统计学意义。生存曲线显示胃癌淋巴结转移灶AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9三阴性表达患者生存期虽然稍长于三阳性表达者,但差别无统计学意义。6.COX回归分析模单因素分析结果显示分化程度、浸润深度及胃癌淋巴结转移灶中AEG-1/MTDH表达是显著影响第一站淋巴结转移胃癌术后生存率的指标(P0.05),无显著影响的指标有:年龄、性别、临床TNM分期、胃癌淋巴结转移灶中NF-κB表达情况及胃癌淋巴结转移灶中MMP-9表达(P0.05)。COX回归分析模型多因素分析显示,胃癌淋巴结转移灶中AEG-1/MTDH表达是影响第一站淋巴结转移胃癌术后生存率的主要指标,还是第一站淋巴结转移胃癌的独立预后因素。[结论]1.AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9在胃癌淋巴结转移灶的表达均较原发灶明显增高,并且已经发生异质性改变,并且与胃癌的临床病理特征相关。2.AEG-1/MTDH可能通过调控NF-κB、MMP-9的表达来参与胃癌的浸润及转移。3.检测胃癌淋巴结转移灶AEG-1/MTDH、NF-κB及MMP-9的表达情况,对研究胃癌转移过程有应用价值。检测胃癌淋巴结转移灶AEG-1/MTDH表达情况,有助于判断胃癌的预后。第三部分:慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH表达对胃癌细胞株SGC7901生物学特性的影响及AEG-1/MTDH、NF-κB、MMP-9信号通路的研究[研究目的]探讨慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH表达对胃癌细胞株SGC7901细胞增殖及迁移的影响,并探讨胃癌细胞中AEG-1/MTDH、NF-κB、MMP-9信号通路情况。[研究方法]采用慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH的表达,采用PT-PCR法检测AEG-1/MTDH抑制效果,通过MTT法和迁移实验分别检测慢病毒介导的shRNA抑制AEG-1/MTDH表达后细胞增殖及迁移的变化,采用Western-blot分析胃癌细胞中AEG-1/MTDH、NF-κB、MMP-9信号通路情况。[结果]1.shRNA干扰72h后,shRNA干扰组胃癌SGC7901细胞株中AEG-1/MTDH mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P0.001)。2. shRNA干扰72h后,采用MTT法分析胃癌SGC7901细胞株增殖变化,shRNA干扰组细胞增殖率较空白对照组和阴性对照组有显著性下降(P0.05)。3. shRNA干扰24h后,通过细胞划痕实验来评估细胞迁移能力的改变,结果显示shRNA干扰组胃癌细胞迁移能力较空白对照组及阴性对照组明显减少。4.shRNA干扰72h后,Western-blot分析显示shRNA干扰组AEG-1/MTDH、NF-κB p65、MMP-9蛋白质水平的表达较空白对照组及阴性对照组均明显下降。[结论]1. shRNA干扰后,胃癌细胞株SGC7901中AEG-1/MTDH mRNA表达显著降低。2. shRNA干扰后,可显著抑制胃癌细胞增殖能力;胃癌细胞迁移能力明显下降。AEG-1/MTDH在胃癌细胞增殖及迁移等方面发挥重要作用,慢病毒介导的RNAi技术抑制AEG-1/MTDH表达有望用于胃癌的基因治疗。3.胃癌SGC7901细胞株中存在AEG-1/MTDH、NF-κB、MMP-9信号通路,AEG-1/MTDH可能主要通过NF-κB信号通路介导MMP-9表达。
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R735.2

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