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纤维素酶转录调控因子及纤维素酶应用的研究

刘奎美  
【摘要】:目前,日益枯竭的石油资源导致了新型可再生能源产业的兴起,现在以木质纤维素生产生物乙醇越来越受到重视。第一代生物乙醇存在与人争粮的问题,因此第二代生物乙醇技术应运而生:利用秸秆、玉米芯等木质纤维素材料生产生物乙醇。在木质纤维素转化为糖的过程中,纤维素酶具有重要的作用。目前工业生产中使用的纤维素酶的来源主要是丝状真菌,如里氏木霉,草酸青霉等。但是在第二代生物乙醇的生产过程中,生产成本过高成为限制该行业发展的主要因素。影响该产业的生产成本过高主要有两方面的原因:一方面的原因是纤维素酶的产量过低;二是纤维素酶的降解效率较低,为了达到较好的降解效果,需要添加纤维素酶的量增多。为了降低纤维素酶的生产成本,研究者进行了多方面的努力。一是对纤维素酶的调控机制进行研究,二是纤维素酶进行复配提高纤维素酶的转化效率,降低纤维素酶的成本。目前,在工业生产中里氏木霉由于较高的纤维素酶产量,是一种重要的纤维素酶生产菌株。研究发现,纤维素酶的调控是一个非常复杂的过程:该过程受到碳源、光照和pH等外面环境变化的影响。纤维素酶转录水平的调控主要是受到纤维素酶转录因子调控如:转录激活因子Xyr1、Ace2和Clr2;转录抑制因子Cre1和Acel。Cre1是纤维素酶主要的转录抑制因子,本实验中对Cre1的功能进行了进一步的研究。同时,研究还发现一些未知的途径参与到纤维素酶的调控,本实验中我们研究发现了一类新型的纤维素酶调控家族-velvet家族蛋白是调控纤维素酶生产的重要因子。同时在本实验中,我们对于利用纤维素酶降解工业废弃物马铃薯渣转化生产葡萄糖的工艺进行了初步的探究。本论文中主要的实验内容包括以下3个方面:1)里氏木霉中velvet家族蛋白功能研究。在里氏木霉中,利用BLAST的方法,找到3个含有velvet结构域的蛋白质,系统进化树分析发现这三个蛋白分别属于VeA, VelB和Ve1C家族,我们将其分别命名为Vel,Vel2和Ve13。利用同源重组的方法,将基因进行敲除,分别获得了Δvel,Δvel2和△vel3菌株,同时研究了在光照和黑暗条件下这三株突变菌株在菌落形态、无性孢子生成和纤维素酶生产的变化。将出发菌株与Δvel,Δvel2和△vel3菌株分别在葡萄糖、甘油和乳糖培养基中,在持续光照和持续黑暗的条件下培养,发现velvet家族参与到菌落形态维持和次级代谢调节过程中:与出发菌株相比,无论是在光照还是在黑暗的条件下,velvet缺失菌株的菌丝分支增多。△vel2的菌落直径变小同时菌落边缘不规则。△vel2不再生产黄色色素而△vel3产生更多的黄色素。△ve1和△vel3菌株生物量没有发生大的变化,然而,△vel2的生物量明显减少。敲除ve1和vel2后,在光照和黑暗条件下都检测不到无性孢子生成;敲除vel3之后,无性孢子的生成量减少,说明ve1和vel2在孢子生成过程中起到关键作用,vel3起到辅助作用。同时检测孢子生成相关基因wetA和abaA的转录水平发现,在velvet缺失菌株中,两者都是下调的,说明velvet家族是通过调节孢子生成途径的关键基因来调节里氏木霉孢子生成过程的。在光照和黑暗条件下,三种velvet缺失菌株纤维素酶的转录水平都发生了大幅度的下调,尤其是在△ve1和△vel2菌株中。滤纸酶活、CMC酶活、pHVC酶活和pNPG酶活的测定,验证了velvet家族蛋白参与到纤维素酶的调控过程中,而且ve1和vel2起到关键作用,vel3起到辅助作用。研究发现,velvet调控纤维素酶表达是通过调控纤维素酶转录激活因子xyr1的转录水平。同时velvet调控纤维素酶表达不受到光调控纤维素酶途径关键基因env的调控,同时也与纤维素酶转录因子clr-2无关,暗示着可能还有新的途径调控纤维素酶的表达。通过检测UPR响应途径的基因转录发现,velvet家族蛋白不参与纤维素酶的分泌过程。velvet家族作为新型转录因子,作用机制还有待于进一步的研究。文献报道发现,velvet结构域能够与brlA等结合,从而调控下游基因的功能。对于velvet家族蛋白如何调控纤维素酶表达,下一步实验考虑可以利用EMSA实验来验证velvet家族蛋白与纤维素酶转录调控因子xyr1和cre1是否结合,从而直接验证velvet家族是通过调控纤维素酶转录因子来调控纤维素酶的表达。同时,研究发现,Vel能够被磷酸化,下一步实验可对磷酸化机制以及磷酸化作用进行详细的研究。2)里氏木霉碳源代谢阻遏因子Cre1研究。纤维素酶转录因子在纤维素酶的生产过程中起到非常重要的作用。转录因子分为转录激活因子和转录抑制因子。里氏木霉碳源代谢阻遏因子Cre1是主要的纤维素酶转录抑制因子,同时研究发现,转录激活因子xyr1的完全表达需要Cre1的存在。完全缺失cre1基因,菌体的生长会受到严重的抑制,导致菌体生长周期明显变长,因此对于降低纤维素酶生产成本没有太好的效果。根据文献报道,里氏木霉Cre1是受到磷酸化调控的。因此本实验对于Cre1的磷酸化对纤维素酶表达影响等方面进行了研究。首先本实验中利用酵母双杂交实验,我们证明了里氏木霉Cre1与酪蛋白激酶(CK)Ⅱ的催化亚基α1具有相互作用,与另外的一个催化亚基α2没有相互作用。据文献报道,CKⅡ在Cre1上磷酸化保守序列是HSNDEDD,其中S241位是磷酸化位点,同时S的磷酸化需要处于酸性环境中。为了研究该序列的变异对于纤维素酶生产的影响,我们利用定点突变的技术,成功获得了7个突变菌株:S241V (S), D243V (D), E244V (E), D243V/E244V (DE), S241V/D243V (SD), S241V/E244V (SE), S241V/D243V/E244V (SDE)。7株突变转化子的生物量都没有发生明显的变化。将出发菌株与7个突变转化子分别利用转接的方法接种到葡萄糖、乳糖和纤维二糖培养基中检测纤维素酶转录水平的变化。与出发菌株相比,在三种碳源培养条件下,S菌株纤维素酶转录水平都发生了明显的下调,原因可能是由于S241突变,导致不依赖磷酸化的永久性结合DNA,导致持续的碳源代谢阻遏。D, SD,SDE位点突变会导致在葡萄糖培养条件下,纤维素酶的转录水平发生大约10倍的上调,在乳糖和纤维二糖培养基中基本没有变化。E位点单独不调控纤维素酶的变化,但是能够影响S和D位点对于纤维素酶的影响,原因是纤维素酶的转录水平变化从大到小为EDED,同时SESDESDO具体的调控机制深入研究。突变转化子在葡萄糖培养基中转录水平提高高于乳糖和纤维二糖。由于Cre1发生磷酸化是在碳源代谢阻遏的条件下,我们研究了在葡萄糖条件下与Cre1具有相互作用的蛋白质,利用免疫共沉淀(Co-IP)的方法,成功获得在该条件下与Cre1可能具有相互作用的蛋白2个蛋白,还有待于进一步进行验证。对Cre1的结构进行预测分析发现,Cre1蛋白在N端含有两个Zn2Cys6锌指结构。二级结构分析发现,Cre1蛋白含有少量的α螺旋和p折叠,含有大量的无规则卷曲,同时发现Crel含有大概80%的亲水氨基酸,说明Cre1具有很强的亲水性。但是现在Cre1的结构尚未被解析。为了对Cre1的结构进行研究,我们利用pGEX-4T-1将Cre1成功的进行异源表达,进行结晶结构分析。同时,为了研究磷酸化状态Cre1的结构,我们获得了Cre1后添加HⅠS标签的菌株,在葡萄糖条件下培养,纯化磷酸化Crel,很遗憾的是没有拿到正确的Cre1蛋白。3)利用纤维素酶降解马铃薯渣生产葡萄糖实验。本实验中马铃薯渣是工业上抽取马铃薯淀粉之后的残渣。试验中马铃薯渣的底物浓度为25%。成分分析发现马铃薯渣中主要成分为淀粉、果胶和纤维素,不含有半纤维素,木素的含量很低。由于草酸青霉JUA10-1的酶液具有较高的纤维素酶比酶活和果胶酶酶活,里氏木霉TX具有较高的p-葡萄糖苷酶酶活。由于马铃薯渣中有较高含量的果胶,是纤维素酶降解纤维素的主要阻碍,因此本实验中还添加了商业的果胶酶。在本实验中利用草酸青霉JUA10-1酶液和里氏木霉TX酶液与果胶酶酶液进行复配降解马铃薯渣里氏木霉降解高温处理马铃薯渣的效果好于降解未处理的马铃薯渣;草酸青霉A10-1降解高温处理和未处理马铃薯渣的效果相差不多,与里氏木霉TX降解高温处理马铃薯渣效果基本一致。在复配实验过程中,分别采用2000PGU/g干物质果胶酶添加不同FPU/g干物质里氏木霉TX或者草酸青霉A10-1酶液;8FPU/g干物质里氏木霉TX酶液或者草酸青霉A10-1酶液添加不同PGU/g干物质果胶酶,达到最高葡萄糖转化率的复配方法是8FPU/g干物质草酸青霉A10-1酶液添加1000PGU/g干物质果胶酶酶液,葡萄糖的转化率为80%,葡萄糖的浓度为83.4mg/ml,葡萄糖转化为葡萄糖酸的转化率为94.9%,葡萄糖酸浓度为81.4mg/ml,葡萄糖酸的生产速率为4.07g/L/h。


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