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对虾肠道菌群动态平衡的免疫调控研究

杨慧婷  
【摘要】:对虾养殖业是我国沿海地区重要的支柱产业。自上世纪90年代以来,对虾养殖中疾病频发,使对虾养殖业屡受重创。为了解决困扰对虾养殖业的疾病问题,科技工作者围绕着宿主(对虾的免疫防御)、病原(包括病原检测、致病机理及防治)和环境(养殖环境的控制)三个方面做了大量的工作,也取得了很大的进展。但疾病防治的问题始终没有很好地解决,养殖中会不断出现新的疾病。如果将宿主-病原-环境三个方面整合起来研究,有望发现养殖中疾病防控的新策略。对虾肠道菌群的功能及其动态平衡调控的研究是将三者联系起来的一个桥梁,因为对虾肠道菌群既与宿主免疫有关,又与环境有关。因此,我们以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)为材料,对肠道菌群动态平衡的调控进行了研究。1.日本囊对虾双氧化酶参与肠道微生物群落动态平衡调控的研究肠道先天免疫反应是抵抗外来病原的一种重要的防御机制。在果蝇的研究中,已知活性氧ROS和抗菌肽在清除肠道病原体中起到重要作用。然而,甲壳动物是怎样维持肠道菌群平衡的,现在还不清楚。我们在日本囊对虾(M. japonicus)中克隆鉴定了一种双氧化酶,命名为MjDUOX2。MjDUOX2是一种跨膜蛋白,N端在细胞外,含有一个19个氨基酸的信号肽和一个554个氨基酸的过氧化酶同源结构域(Peroxidase homology domain, PHD);有7个跨膜域;细胞内的部分含有3个EF结构域(钙离子结合域),一个104氨基酸的黄素腺嘌呤二核甘酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)结合结构域和一个156氨基酸的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)结合结构域。MjDUOX2和已报道的日本囊对虾中的DUOX(命名为MjDUOX1)有较低的相似度(26.84%)。检测两种MjDUOX在日本囊对虾中的组织分布,发现MjDUOXs的mRNA广泛表达于血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃和肠中。经口感染弧菌后,肠道中MjDUOXs上调表达,且活性氧(ROS)水平升高。通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)的方法敲低MjDU OXs基因的表达,肠道中ROS水平下降,细菌数量升高。利用RNA干扰技术敲降MjDUOXs的表达并感染病原菌后,对虾存活率明显下降。上述结果表明,能够产生ROS的MjDUOXs在对虾肠道菌群的动态平衡调控中发挥重要作用。2.日本囊对虾过氧化氢酶降低活性氧ROS水平并参与肠道微生物的稳态调控活性氧包括过氧化物、超氧阴离子和羟自由基等。作为一种强氧化剂,具有广泛杀灭微生物作用,包括细菌、病毒和真菌等。近年来研究也发现活性氧在细胞的增生、分化、凋亡等的调控中也起重要作用,被认为是一种新的第二信使。同时过量的活性氧也可以引发生物大分子及生物组织的氧化损伤。前面的研究发现DUOX可以在肠道细菌刺激的情况下产生活性氧,但对虾肠道中多余的活性氧是如何清除还不了解。本研究中,我们从日本囊对虾中克隆得到的一种过氧化氢酶(Catalase,CAT),并命名为MjCAT。利用半定量PCR方法检测MjCAT的组织分布,结果显示其mRNA在血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃和肠中都有表达。经口感染病原菌-弧菌后,肠道中蚴CAT的表达量上调,酶活性升高,ROS含量在短时间内上调并很快恢复。当用RNAi方法将MjCAT基因表达敲低后发现,ROS水平升高,并能保持较长时间。同时,对虾肠道内的细菌数量与对照组相比明显降低。干扰MjCAT并感染病原菌,对虾存活率也显著降低。观察MjCAT干扰后对虾肠道的组织结构,发现肠腔中绒毛受到损伤。这些结果表明,MjCAT可以调节肠道中ROS水平并调控宿主肠道与微生物间的稳态。3.肠道菌群的识别与动态平衡调控的分子机理在果蝇的研究中,DUOX在保持肠道微生物动态平衡过程中起到重要作用。但是宿主如何识别肠道菌群、并激活下游肠道菌群调控的信号途径还不清楚。本研究中,我们首先对通过转录组测序得到的5种G-蛋白偶联受体(Guanosine-binding Protein Coupled Receptor, GPCR)进行了筛选,得到了一种与MjDUOXs表达相关的GPCR,根据其结构域组成命名MjMeGPCR。MjMeGPCR的表达进行RNA干扰,显示MjDUOXs的表达量减少,且ROS水平降低;过表达MjMeGPCR, MjDUOXs的表达量升高,且ROS含量升高。另外,MjMeGPCR可以与多种细菌结合。我们还对该信号途径下游的分子包括活化转录因子-2 (Activating transcription factor-2,ATF2)和有丝分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK) p38 (Mjp38)进行了研究。当抑制细胞质中Ca2+回流入内质网时,ROS水平升高:当抑制信号通路中的Mjp38活性或干扰MjATF2 时,DUOX的表达量降低,ROS含量也降低。上述结果表明,肠道菌可以被MjMeGPCR所识别,通过p38和ATF2调控MjDUOXs的表达。此外并使Ca2+释放,调控MjDUOXs的表达和活性,使肠道产生ROS,调控肠道菌群的平衡。


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